1 引言
全基因组关联研究(genome-wide association studies, GWAS)和人类大脑的基因表达谱揭示了研究复杂大脑现象的遗传基础的能力。这些数据集主要用于非侵入性成像研究，特别是与结构MRI或静息状态fMRI的相关性。现有的方法依赖于已发表的死后脑基因表达数据集，这意味着神经生理和行为数据不是来自提供基因表达数据的同一人。这限制了此类方法确定基因如何支持关键的认知过程(如情景记忆)的潜在影响，并突显出开发新的个人同时贡献了神经生理和基因表达数据的数据集的必要性。另一个影响先前研究的问题是，神经生理测量，如静息状态fMRI，与认知现象没有直接联系。因此，我们以前试图将基因表达水平与成功记忆编码的振荡特征联系起来，因为这些振荡在支持记忆行为方面的基本作用已经在啮齿类动物和人类中得到了很好的确立。这些振荡特征是对编码成功的记忆在给定频带内调制振荡功率的程度的衡量。他们使用植入癫痫标测的颅内电极进行量化，并在受试者执行情景记忆任务时进行记录。我们使用了一个超过10年的颅内脑电图(iEEG)记录的大型数据库，拼凑出这些振荡信号在大脑各区域的分布。我们确定了与这些振荡信号相关的基因，包括那些以前在啮齿动物研究中与记忆形成有关的基因，与自闭症谱系障碍(autism spectrum disorder, ASD)等认知障碍相关的基因，以及作为进一步研究的主要目标的新基因。然而，与其他研究一样，该数据集并不能同时受益于来自同一个体的神经生理和基因表达信息。
为了阐明基因表达和大脑振荡之间的联系，并确定神经调节治疗记忆障碍的有利靶点，在这里，我们汇编了一个史无前例的数据集，来自16名首次接受iEEG的人类受试者，在此期间，我们使用一条完善的信号处理管道测量了情景记忆编码的振荡特征。这些受试者随后接受了颞叶切除术，在此期间，颞叶外侧的整体切除允许获取高质量的组织样本，这些样本在从先前获得活体记录的共同脑区(Brodmann Area 38(BA38))切除后立即进行处理。这种方法使我们能够通过将基因表达信息与从相同个体获得的iEEG数据相关联来识别与记忆振荡特征相关联的基因。使用以下不同的步骤进行优先排序：多变量分析(MVAs)，然后使用相关性通过脑振荡进行分解；基因调控网络连通性和特定细胞类型的表达和/或表观基因组状态；以及免疫荧光染色确认。这种强大的分析方法结合了iEEG的人类电生理数据和来自相同受试者的基因组数据，突出了可能与情景记忆机制相关的基因。
我们先验地决定在这项分析中关注BA38，原因如下：(1)多项研究表明，该区域表现出强烈的记忆相关振荡特征；(2)在整块颞叶切除手术中，该区域的切除是标准化的，从而允许保持该区域的血液供应；(3)在这一特定人群中，颞叶切除前的iEEG检查总是包括从该区域取样。
我们的数据集的一个固有的特征是受试者患有顽固性癫痫，这对解释结果提出了一个重要的警告。然而，最近的实验表明，参与认知研究的癫痫患者在成功编码过程中引发的血氧水平依赖模式与健康对照组相比并没有显示出显著的差异。此外，由于我们检查了这些个体的基因振荡特征相关性，而不是与另一组数据进行比较，我们可以建立控制方法来部分解释这一担忧。
2 方法与结果
2.1 个体内记忆振荡特征和基因表达数据集的生成
为了确定记忆相关的大脑振荡和基因表达之间的关系，我们分析了受试者的iEEG，以及来自相同16个人的基因表达数据。通过比较成功和不成功记忆编码期间的振荡模式，从记录的iEEG信号计算成功记忆编码的振荡特征(后续记忆效应(subsequent memory effects, SMEs))。我们使用自由回忆任务，这是振荡模式可以很好地被描述的对情景记忆的一种标准测试，并利用我们完善的信号处理流水线(图1)计算了振荡特征。平均而言，受试者记住了24.3%的记忆项目，列表侵入(错误记忆)的比率为5.4%。这些特征揭示了自由回忆的预期模式，包括优先和最近效应，以及即时滞后的时间邻接性。
图1 个体内研究设计和质量控制
通过首先对小波分解后的iEEG信号进行归一化，并在2至120 Hz的56个对数间隔频率上统计比较成功和不成功编码事件之间的振荡值，从位于颞极的电极中提取SMES。这是使用排列程序完成的，即在每个记录电极内对试验标签进行1000次洗牌。我们先验地决定通过专家神经放射学检查，对位于颞前极(BA38)的所有电极上的每个个体的振荡数据进行平均，因为这似乎是最普遍的方法。结果，所有频带的受试者之间的SME值的方差大于受试者内的方差，这支持了该方法的有效性。数据平均每个受试者的3.6个电极。在将这些数据输入我们的模型以估计基因相关值之前，所产生的振荡特征被平均到六个预定义的频带(图1d, f)。在成功和不成功的编码之间，显示出振荡功率显著差异的电极的比例表明存在显著的与记忆相关的振荡模式，在个体水平上的显著影响也被显示出来(图1d)。此外，观察到的SME值之间的相关性揭示了低频和高频SMEs之间的预期关系。我们注意到，观察到的差异可能是由于窄带振荡或宽带功率漂移(或两者的混合)的功能变化所致。这16名研究受试者随后接受了颞叶切除术。使用在这些受试者中标准化的技术从BA38获取组织(图1e)。发作于颞极的受试者不包括在我们的数据中。
我们从16个BA38样本中产生了完整转录组RNA测序(RNA-seq)数据。除了16个具有匹配的振荡特征测量和基因表达数据的人外，我们还从另外11个未获得振荡测量的人的颞叶切除术中生成了BA38 RNA-seq数据，以及来自12个健康人和8名癫痫患者的尸检组织，以使用排列/引导来验证我们的预测(图1F和方法)。主成分分析显示，各样本的基因表达是一致的，没有异常值。在进一步分析之前，分析并消除由技术、生物和测序协变量解释的差异。这些调整后的基因表达值被用来计算每个频带和共表达网络中个体间的基因振荡特征相关性。
2.2 记忆振荡特征与基因表达相关
为了确定记忆振荡特征和基因表达之间的关系，我们进行了MVA，然后使用Spearman等级相关进行大脑振荡分解，其中包括上述排列/引导。基因表达和大脑振荡之间的相关性是在受试者之间进行的，每个受试者在每个频段贡献一个基因表达值和一个SME值。MVA共检测到753个SME基因表达相关性的假发现率(FDR)校正P值<0.05(图2a)的基因。我们确定的重要基因的F-统计量是稳健的，并且比非显著基因的F-统计量大。然后，我们通过相关分析来分析记忆相关振荡信号在6个频带中的表达情况。在MVA检测到的753个基因中，有300个基因与特定频段的记忆效应有关，其中很高比例与2-4 Hz的δ频带振荡有关(图2a)。大多数已鉴定的基因只针对一个频带，主要只有少数基因由δ和另一个频带共享(图2b)。Spearman的ρ值是稳健的，并且大于随机预期。这些结果进一步证实了已鉴定基因的重要性。
图2 与SMEs相关的基因是不同的
来自这16个人的数据还包括一个控制行为范式，在这个范式中，个体完成简单的数学问题，这使得我们能够观察到与这个独立的认知领域相关的振荡特征。我们进行了与上述相同的分析，以测试基因振荡特征关联是否对记忆处理有特异性。我们的数据集还包括每个个体BA38的皮质厚度估计，这些估计是从我们的FreeSurfer处理程序中提取的，使我们能够执行额外的对照分析，以寻找与此测量相关的基因。我们没有观察到与这些替代数据的重叠，下面使用共表达网络分析突出显示的所有基因都是记忆特异性的(也就是说，基因振荡相关性是记忆相关振荡效应的特异性)。最后，我们寻找与记忆表现相关的基因(即，不考虑任何振荡特征观察的行为数据)。只有一个与振荡特征相关的基因与这些对照分析中识别的基因重叠，从而加强了通过检查基因-振荡特征相关性获得的独特的记忆相关信息(图2c)。
2.3 网络完善与记忆相关的分子通路
我们试图理解被确认为与成功记忆编码的振荡特征相关的基因的功能特性。我们使用切除的颞叶组织的基因表达和死后基因表达数据集进行了共识加权基因共表达网络分析(WGCNA)。我们将记忆基因放在系统水平的背景下，以确定与大脑振荡相关的共表达网络，从而进一步确定基因的优先顺序。我们要求所标识的模块在这些多个表达式数据集中是稳健的，总共标识了26个模块，其中有6个与振荡特征相关基因显著相关(图3a)。
图3 基因共表达网络突出了与记忆编码有关的细胞过程
两个模块与增量振荡特征显著相关，一个模块同时具有δ和低γ振荡，三个模块与β振荡特征显著相关(图3a)。值得注意的是，我们没有检测到与皮质厚度或回忆分数相关的基因的模块关联，而与数学任务中的振荡相关的基因与两个独立的模块相关，这进一步证实了与记忆编码及其网络相关的基因是不同的(图3b)。此外，在其中三个模块(WM4、WM12和WM21)中，我们发现SME基因显著富集。与其他基因相比，这三个模块中的SME基因显示出更高的连通性，这表明振荡信号相关基因在BA38的转录组中起着核心作用。我们还观察到了与振荡特征相关基因相关的基因和模块的收敛(图3c)。使用不同的患者群体和方法，这些发现的趋同使我们对这些基因和记忆过程之间的联系的推论更有信心。与δ振荡信号正相关的两个模块(WM4和WM12)富含与离子通道活动有关的基因(图3d)。值得注意的是，WM4包含先前发现的与记忆振荡信号相关的基因，而WM12则富集了先前发现的与记忆振荡信号相关的突触相关模块(图3c)。
因SHANK2是WM12中枢基因之一，编码突触支架蛋白。SHANK2的突变与自闭症、智力残疾和精神分裂症有关，还与学习和记忆缺陷有关，从而进一步证实了WM12中枢基因在记忆编码中的关键作用。重要的是，与不同振荡频带相关的模块表现出不同的功能特性。与δ相关模块相反，与β振荡信号(WM11和WM22)相连的模块与选择性剪接和染色质重塑显著相关(图3d)。根据先前的结果，我们观察到这两个模块都富集了SME15中的基因，该模块与包含剪接相关基因的β振荡信号相链接(图3c)。这些数据可能支持选择性剪接调控作为个体间观察到的振荡特征变化的一种机制。
2.4 记忆振荡信号模块与神经精神障碍有关
接下来，我们研究了SME模块与来自大脑疾病的基因组数据之间的关联。使用来自多种疾病的综合转录和遗传学数据，我们使用连锁不平衡(linkage disequilibrium, LD)分数回归来评估神经精神障碍中调节失调的基因的富集和GWAS的富集。与δ振荡信号相关的WM4模块在自闭症和与自闭症相关的变体中显著富含下调的基因(图4a, b)。WM12显示与注意力缺陷/多动障碍、双相情感障碍、严重抑郁障碍、精神分裂症以及与教育程度和智力有关的变体的GWAS表现出丰富的特征(图4b)。最重要的是，我们没有在记忆相关模块(图4b)中检测到任何显著的癫痫相关位点的富集，而且与大脑无关的特征和疾病相关的变体的富集程度很低。我们还从SFARI基因数据库中发现了ASD相关基因中WM4和WM12的富集(图4c)。
图4 SME特异性模块捕捉神经精神障碍中调节失调的基因
接下来，我们将相关模块与神经精神障碍转录数据荟萃分析中发现的模块进行了比较。WM4和WM12都富集了一个严重受ASD影响的模块RBFOX1。有趣的是，RBFOX1也是WM12(图3d)中的一个枢纽，这为该基因在神经精神障碍和记忆中的作用提供了进一步的支持。β模块WM21富含精神分裂症变体(图4a, b)，而β模块WM22富含精神分裂症影响的剪接模块。总体而言，δ和β振荡信号相关模块与记忆受损的神经精神障碍的关联为这些基因和通路在情景记忆中的作用提供了进一步的支持。
2.5 记忆振荡特征的模块与特定的细胞类型相关联
为了建立识别的相关基因的细胞类型特异性关联，我们对六名受试者的组织进行了单核RNA-seq(snRNA-seq)分析，其中四名受试者提供了振荡数据。我们对17632个核的转录本进行了测序，检测到11498个唯一分子标识符(unique molecular identifiers, UMIs)和4069个基因的总体中位数。在降维之前，我们考虑了技术和生物的协变量。我们最初确定了24个星团。接下来，我们使用了一个来自颞中回的公开可用的snRNA-seq数据集，通过细胞类型和层特异性进一步定义了我们的初始簇。在基于标记富集的比较之后，我们专注于一组强大的20个转录定义的簇(图5a)。我们定义了9个抑制性神经元，8个兴奋性神经元和3个主要的非神经元簇。这些簇显示其各自细胞类型的已知主要标记的高表达(图5b)。
图5 SME特异性模块丰富了兴奋性和抑制性神经元
我们发现，与δ相关的模块WM4和WM12对兴奋性和抑制性神经元有强烈的富集作用(图5c)。具体地说，WM4和WM12对Rorb THEMIS Fezf2 深层兴奋性神经元的组合高度富集。这些深层神经元与从海马接受GABA能输入的记忆编码电路有关。此外，δ节律性可能来自向其他皮质下区域投射的更深层的内在神经元。因此，这些结果进一步强调了这些深层兴奋性神经元在情景记忆编码中的重要性。此外，两个模块对SST VIP PVALB 抑制性神经元的组合均表现出富集作用。有趣的是，含有快速尖峰小蛋白(PVALB)的篮子细胞决定性地控制兴奋性输出，它们是调节新皮质-海马回路的记忆巩固所必需的。同时，表达生长抑素(SST)的神经元以锥体细胞的远端树突为靶点，它们在记忆回路和大脑皮层振荡同步中发挥作用。当SST PVALB 中间神经元特异性地抑制锥体神经元时，VIP 神经元既抑制又不抑制锥体神经元，并且可能与工作记忆回路有关。
此外，与δ振荡信号负相关的模块WM21对胶质细胞来说是丰富的，与少突胶质细胞相关的基因占主导地位(图5c)，这为少突胶质细胞在记忆回路和神经元同步中可能发挥的作用提供了支持。此外，利用来自ASD或阿尔茨海默病患者脑组织的snRNA-seq数据，我们发现WM4显著富集ASD中第2-4层兴奋神经元和SST 抑制神经元中调控失调的基因，而WM21显著富集受阿尔茨海默病影响的少突胶质细胞标志物。这些结果证实了与δ振荡信号相关的模块在细胞类型水平上与认知障碍有关的作用。
WM4和WM12都富含与δ振荡信号相关的基因、与认知疾病相关的变体和多种神经元类型。为了验证我们的方法，以确定针对大脑疾病和细胞类型的神经调节策略未来发展的目标，我们从其中一个δ模块中选择了一个中枢基因。IL1RAPL2是WM4模块中的HUB基因，与类似的IL1RAPL1一起，促进功能性兴奋性突触和树突棘的形成，并与ASD相关。我们的snRNA-seq数据表明，IL1RAPL2在RORB 深层兴奋性神经元中表达最高，但也在SST LAMP5 上层抑制性神经元中表达(图5d)。对独立获得的组织切片的荧光免疫组化(IHC)分析表明，IL1RAPL2与兴奋性神经元标记(CAMKII)重叠表达最多，与抑制性神经元标记(GAD67)重叠，与星形胶质细胞(GFAP)或少突胶质细胞标记(OLIG2)不重叠(图5e, f)。除了在兴奋性突触形成中的作用外，snRNA-seq与记忆振荡信号的关联也表明IL1RAPL2可能在人类记忆编码的调节中发挥重要作用。总之，这些结果强调了进一步研究IL1RAPL2在记忆和兴奋性抑制性突触病因中作用的重要性。
2.6 snATAC-seq揭示了转录因子是记忆相关模块的关键调节因子
接下来，我们试图了解是什么转录因子(transcriptionfactors, TFs)调节记忆振荡信号模块。我们对来自三个不同受试者的组织进行了单核ATAC-SEQ(snATAC-SEQ)分析。我们评估了22177个核的染色质状态，识别峰的中位数为7733个。我们通过整合snATAC-seq数据与snRNA-seq数据(图6a)识别出17个被标记的簇。来自三个受试者的核比例在簇中的分布相似。我们注意到snRNA-seq和snATAC-seq数据集在所识别的细胞类型方面的分辨率差异，snATAC-seq数据集中非神经细胞的比例很高。我们推测，这种差异可能是由于神经细胞类型中更多的RNA和表达基因导致snRNA-seq数据中的偏差所致。事实上，人类灰质中胶质细胞与神经元的比率(GNR)在1.13和1.64之间变化。snATAC-seq解析的GNR符合这一假设，而snRNA-seq数据低估了GNR。
图6 snATAC-seq强调调整SME相关模块的TFs
总体而言，这种多组学方法使我们能够检测到其可及性特征与细胞类型基因表达一致的细胞类型特异性调控位点。利用基序分析，我们探索了TF在与识别的记忆振荡信号模块相关的细胞类型特定调控位点中的富集。在具有细胞类型关联的模块中，仅在WM12中检测到基序富集(图6b)。有趣的是，我们发现WM12显示出SMAD3基序的富集，这是一个WM12中枢基因(图6b)。值得注意的是，在其他与神经精神障碍和记忆相关的WM12中枢基因的启动子区域也观察到了SMAD3基序，如SHANK2(图6c)。此外，WM12包含与神经元病因相关的基因，我们发现SMAD3主要在兴奋性神经元中表达(图6d)。独立获得的组织切片的荧光IHC分析进一步证实了这一结果(图6e,f)。总体而言，这些结果强调了特定的TFs在调节染色质情况中的作用，这些染色质情况是表达与记忆振荡信号相关的假定基因所必需的，并为理解人类记忆提供了新的分子切入点。
3 讨论
我们着手于了解支持人类情景记忆编码的振荡模式的基因组基础，目的是识别哪些基因是治疗记忆障碍的神经调节策略的有利目标。使用来自16名人类受试者的数据集，其中包括对与成功的情景记忆编码有关的大脑振荡的测量，以及来自相同个体颞极的转录数据，我们识别了将特定细胞类型和细胞功能与记忆相关振荡特征联系起来的基因模块。
成功记忆编码的振荡关系代表了基因调控和记忆行为之间的“中间步骤”。振荡被定位于大脑区域，使用颅内深度电极记录它们，并分解成具有不同特性的频带。将神经生理学测量与基因表达数据联系起来，在随后对这些已识别基因的研究中建立具体的可检验假说。图3d中描述的中枢基因可能代表了使用动物模型或其他方法进行后续测试的最有利的靶点。
我们的工作揭示了导致成功记忆编码的振荡关联的分子机制。我们观察到δ振荡信号与离子通道基因有关，并且这些基因倾向于在少突胶质细胞中表达，这导致了一个有趣的暗示，即与人类记忆加工有关的低频振荡模式的产生至少部分依赖于胶质细胞对振荡的调节。这是基于我们对所有受试者的观察和单核表达分析。这一结论得到了少突胶质细胞在学习和记忆中的作用，它作用于膜电位的去极化，加速了轴突传导和离子通道活动，这反映在正相关的δ模块(WM4和WM12)上。此外，在这些正相关模块中表达的基因在与记忆编码电路和δ节律性形成有关的兴奋性神经元的深层以及在SST VIP PVALB 表达的中间神经元中过度表达，这些中间神经元在记忆编码过程中对介导皮层-海马通讯至关重要。这些结果进一步支持了识别的基因在记忆编码中的作用，并特别强调了可能与情景记忆有关的细胞类型。
我们观察到与δ振荡相关的基因的有趣特性，但没有观察到θ振荡，这与啮齿动物的数据相反，后者普遍表明θ频率活动与成功的记忆形成有关。然而，在人类颞叶中，4-9赫兹范围外的振荡通常表现出与记忆相关的特性，包括交叉频率耦合；因此，我们的发现与之前使用人类成功记忆编码的振荡特征观察到的结果是一致的。在人类中，这些低频振荡代表了记忆形成振荡特征的一致特征，包括对单位活动时间的影响。在我们的分析中，与δ振荡特征相关的基因的显著表现可能反映了这些低频成分在人类中的功能重要性。
我们的分析的几个特征，例如与癫痫相关的基因变异缺乏富集，以及与癫痫和健康组织的数据整合，让我们相信，我们所发现的现象代表了基因表达和大脑振荡之间更普遍的联系。此外，在我们的分析中，采用了严格的伪影排斥标准，移除了位于癫痫发作起始区的电极，从而减少了异常活动对观察到的振荡信号的影响。我们还在我们的分析中整合了几个控制步骤，包括纳入癫痫持续时间来调整基因表达值。最后，我们确定的几个关键基因(例如IL1RAPL2和SMAD3)已经被独立地证明与非癫痫个体和基因啮齿动物模型的数据中的记忆处理有关。尽管这些相关分析并不意味着因果关系，但这些基因已经被严格的相关统计数据、与记忆振荡相关的模块的高度连通性以及细胞类型表达的特异性所突显。利用这种分析方法，我们将IL1RAPL2和SMAD3定义为情景记忆的基因组标记，以便在分子水平上对模型系统进行进一步的研究。
总体而言，本文工作建立了一种实验和分析方法，用于使用整合的生理学和多组学技术来解构人类的行为和认知特征。通过整合单核、转录和表观基因组数据，我们可以确定记忆相关基因共表达模块的细胞类型特异性以及这些模块的潜在调控因子。人类记忆的这种分子特征突出了可以在模型系统中进一步研究的关键基因。我们预计，这种个体内的方法可以用于未来的研究，以突出其他人类复杂特征的分子途径，目标是确定治疗靶点，并在个体水平上将临床和基因组数据联系起来。重要的是，使用动物和体外模型的研究将是必要的，以确定我们分析中确定的基因与记忆相关的特性。
