空间转录组在20年被nature methods评为年度技术，其可能成为继单细胞分析后的下一波热潮，而肝癌领域的第一篇空间转录组文章终于在近期见刊，在2021年12月17号发表于SCIENCE ADVANCES，题目为：Comprehensive analysis of spatial architecture in primary liver cancer，今天我们一起来学习一下。
异质性是癌症预防和治疗的主要挑战。该研究首先构建了原发性肝癌(PLC)的高分辨率空间转录组图谱，包含来自7名患者21个组织中的84,823个spot。将空间肿瘤微环境(TME)特征从非肿瘤区、边缘区到肿瘤区进行渐进式比较，发现肿瘤包膜可能影响肿瘤内空间簇连续性、转录组多样性和免疫细胞浸润。在局部，该研究发现在100mm宽的簇-簇边界上的双向配体-受体相互作用有助于维持肿瘤内结构，而PROM1 和CD47 肿瘤干细胞龛位与TME重塑和肿瘤转移有关。最后，该研究提出了一种TLS-50标记，用于在空间上精确定位三级淋巴样结构(TLS)，并揭示了TLS的独特组成是由它们与肿瘤细胞的距离决定的。该研究为原发性肝癌的多种肿瘤生态系统提供了以前未知的见解，并为癌症干预提供了潜在的指导。
研究结果：
利用空间转录组对原发性肝癌的结构探索
为了全面分析PLC的空间异质性,该研究收集了7个病人的21例组织，包括5例肝细胞癌(HCC-1 HCC-5), 1例合并肝细胞和胆管细胞型肝癌(cHC-1),和一个ICC (ICC-1)患者，利用10X Genomics空间技术进行了空间转录组测序。所有切片的大块组织也全部做了全外显子组测序(WES)，用PBMC作为对照。
本研究中单个spot（包含8到20个细胞左右）直径为55um，在捕获区域，每个切片（6.5mm x 6.5mm）包含5000个spot。对于平均测序深度，单个spot大约包含30000UMI和3000个基因，而肿瘤组织区域UMI数量要高于正常组织。
原发性肝癌空间异质性的不同表型
为了表征原发性肝癌的空间多样性，该研究将来自每个患者不同部位的spot进行了聚类分析，并用UMAP展示。
如图2A所示，该研究发现HCC-1T、HCC-3T和HCC-4T中的聚类具有区域分布特征，而HCC-2T和cHC – 1T中的聚类是相互交织的。HCC-3L中的Cluster 5是一个独特的Cluster，在HCC-3N和HCC-3T中都没有出现。
接下来，该研究还使用基于基因的策略来比较不同亚群中不同细胞类型的得分。值得注意的是，间质区域的成纤维细胞和内皮细胞评分明显较高，不同肿瘤簇区域的免疫细胞评分表现出高度的多样性。
通过拟合细胞类型得分的变化曲线（包括T细胞、B细胞、自然杀伤细胞(NK)、髓系细胞、内皮细胞和成纤维细胞），该研究发现与基质区域相关的簇状细胞形成了成纤维细胞、内皮细胞甚至免疫细胞的变异表型。
肿瘤边缘区域的微环境特征
如图2A所示，肿瘤团簇的空间分布呈现两种不同的模式。一种为块状，簇间界限清晰(如HCC-1T、HCC-3T)，另一种为不连续、混合型(如HCC-2T)。为了定量地评估这一特征，该研究引入了一个名为“空间连续性度”的度量，通过比较每个点与其相邻点之间的聚类一致性来计算它。联合另一个度量指标“转录组多样性度”一起，该研究定量地发现肿瘤边缘和肿瘤区域的转录组异质性，并且HCC-1、HCC-3和HCC-4患者的切片具有较高的空间连续性和较低的转录组多样性。
原发性肝癌肿瘤内部异质性
为了探究肿瘤区域在边缘和肿瘤切片上的异质性，该研究对肿瘤区域每个spot计算了Hallmark通路表现，并最终确定了两个模块。模块1显示了细胞周期和代谢相关通路的高活性(例如，MYC靶点v1, G2-Mcheckpoint, E2F靶点，胆固醇稳态，胆汁酸和脂肪酸代谢)，而模块2在炎症，血管生成和上皮-间质转化中有更高的活性(EMT)通路。
原发性肝癌异质性肿瘤干细胞（CSC）的功能分析
CSCs被认为是肝癌肿瘤内异质性的重要因素。不同的肿瘤干细胞标记物所定义的不同细胞亚群可能包含不同的致癌驱动因子。在这里，该研究集中探讨了五种常用的肝癌干细胞相关标志物(CD47、EPCAM、KRT19、PROM1和SOX9)。对于每个标记物（marker），将每个患者肿瘤spot中表达量最高的前5%的spot定义为标记物阳性的CSC生态位。
通过比较L/T/P部分CSC生态位的比例，该研究发现在HCC-2中，CD47-、SOX9-和PROM1阳性的比例逐渐增加，而EPCAM或KRT19基因并没有表现出这样的现象。
一个完整的HCC结节内的整体异质性
为了更好地在整体范围内研究肿瘤内的异质性，该研究收集了1例直径约1cm的HCC，用4个切片覆盖其中心平面进行了空间转录组分析。该研究将这四个部分的spot进行整合，通过无监督聚类得到6个亚群。这六个亚群在每个截面上都有不同的分数，根据H&E染色和不同的基因表达模式，其可以标注为正常区域(cluster 4)、基质细胞区域(cluster 3/6)和肿瘤区域(cluster 1/2/5)。
三级淋巴结构（TLS）的空间分布及临床特征
TLS是一种异位的淋巴结构，为DC的成熟、抗原呈递以及T和B细胞的激活和分化提供了一个区域，这与抗肿瘤免疫反应和潜在的免疫治疗反应有关。在这里，该研究注意到HCC-5的cluster 6具有高表达CXCL13、CCL19、CCL21、LTF、LTB、CD79A/B等的特征，这些都是TLS形成的必要分子。通过与H&E染色相结合分析，cluster6被鉴定为TLS区域。该研究选择了cluster6中高特异性表达的前50个基因（TLS-50）作为特征基因，并测试了其识别TLS的能力。病理学家证实，与其他信号(包括乳腺癌、12-趋化因子、T辅助性1和B细胞、T滤泡辅助性细胞、CXCL13和浆细胞信号)相比，TLS-50可以识别信号噪声比更高的TLS区域。通过使用TLS-50定位不同切片的TLS点，该研究发现它们主要存在于L切片而不是T和N切片，尤其是在L切片的非肿瘤区域。
总结
本研究采用10X空间转录组技术在55mm分辨率下综合分析了7个原发性肝癌病人的全基因组转录组异质性。通过对正常、边缘和肿瘤区域进行渐进式比较，该研究发现肿瘤包膜可能影响肿瘤内空间簇连续性、转录组多样性、免疫细胞浸润和肿瘤标志通路活性。同时，该研究综合分析了肝癌的几个局部空间特征，包括100mm宽的肿瘤亚群间边界、肿瘤干细胞生态位和三级淋巴细胞组成。
