下面号召大家参与
我们的《单细胞文献100》活动激起了大家对单细胞的兴趣， 马上交流群有朋友咨询B细胞的细分亚群，希望给出参考文献，我恰好在看新冠病毒相关单细胞数据分析文章， 就给出来了这个：《Single-cell landscape of immunological responses in patients with COVID-19》
该研究的实验设计很清晰，就是 5 个正常人加上13个患者 的 血液进行单细胞转录组 ：
- healthy donors (HDs) (n = 5),
- moderate (n = 7),
- severe (n = 4)
- convalescent (n = 6) samples
实验设计
第一层次降维聚类分群
总共是 122,542 cells ，第一层次降维聚类分群是14个：
- naive-state T (naive T) cells (CD3 CCR7 )
- activated-state T (activated T) cells (CD3 PRF1 )
- mucosal-associated invariant T (MAIT) cells (SLC4A10 TRAV1-2 )
- γδ T cells (TRGV9 TRDV2 )
- proliferative T (pro T) cells (CD3 MKI67 )
- natural killer (NK) cells (KLRF1 )
- B cells (MS4A1 )
- plasma B cells (MZB1 )
- CD14 monocytes (CD14 mono; LYZ CD14 )
- CD16 monocytes (CD16 mono; LYZ FCGR3A )
- monocyte-derived dendritic cells (mono DCs; CD1C )
- plasmacytoid dendritic cells (pDCs; LILRA4 )
- plate- lets (PPBP )
- hemopoietic stem cells (HSCs; CYTL1 GATA2 ).
其umap可视化如下所示：
第一层次降维聚类分群可视化umap
这个配色其实不容易区分，虽然色彩很饱满。每个细胞亚群各自标志性基因的表达量展示，文章也做的很好，这里就不赘述。以前我们做了一个投票：可视化单细胞亚群的标记基因的5个方法，下面的5个基础函数相信大家都是已经烂熟于心了：
- VlnPlot(pbmc, features = c("MS4A1", "CD79A"))
- FeaturePlot(pbmc, features = c("MS4A1", "CD79A"))
- RidgePlot(pbmc, features = c("MS4A1", "CD79A"), ncol = 1)
- DotPlot(pbmc, features = unique(features)) RotatedAxis()
- DoHeatmap(subset(pbmc, downsample = 100), features = features, size = 3)
核心分析：细胞比例变化和差异分析
单细胞的多组对照设计（例如正常组与给药组）可以为细胞类型水平比较提供以往Bulk RNA-seq分析所不能达到的精度。对此一般有两种进阶分析思路：
- （1）DE(Differential expression)--两组样本的同一细胞类型的基因表达差异分析；
- （2）DA(Differential abundance)--两组样本的同一细胞类型的丰度差异分析
参考：http://bioconductor.org/books/release/OSCA/overview.html
这个文章《Single-cell landscape of immunological responses in patients with COVID-19》的figures2和figures3就分别对应细胞比例差异分析和基因表达量差异分析。
各个亚群细分
首先是NK,CD4和CD8细分
第二层次降维聚类分群是：
- 6 subtypes of CD4 T cells (CD3E CD4 ),
- 3 subtypes of CD8 T cells (CD3E CD8A )
- 3 subtypes of NKT cells (CD3E CD4–CD8A–TYROBP ).
NK,CD4和CD8细分
如上图所示，出现了第三层次降维聚类分群：
- naive CD4 (CD4 naive) T cell (CCR7 SELL )
- memory CD4 (CD4 memory) T cell (S100A4 GPR183 )
- effector memory CD4 (CD4 effector memory) T cell (S100A4 GPR183 GZMA )
- regulatory T (Treg) cell (FOXP3 IL2RA )
- naive CD8 (CD8 naive) T cell subset (CCR7 SELL )
- effector CD8 T cell subsets (CD8 effector-GZMK and CD8 effector-GNLY),
- naive NKT (NKT naive) cells (CCR7 SELL ),
- CD56 NKT (NKT CD56) cells
- CD160 NKT (NKT CD160) cells
有了这些细分的生物学功能亚群，然后又可以进行核心分析：细胞比例变化和差异分析
单细胞的多组对照设计（例如正常组与给药组）可以为细胞类型水平比较提供以往Bulk RNA-seq分析所不能达到的精度。对此一般有两种进阶分析思路：
- （1）DE(Differential expression)--两组样本的同一细胞类型的基因表达差异分析；
- （2）DA(Differential abundance)--两组样本的同一细胞类型的丰度差异分析
参考：http://bioconductor.org/books/release/OSCA/overview.html
划重点：B细胞的细分亚群
如下所示：
B细胞的细分亚群
主要是6大亚群：
- one naive B subset (MS4A1 IGHD )
- one memory B subset (MS4A1 CD27 )
- one intermediate transi- tion memory B subset (intermediate memory B; IGHD CD27 )
- one germinal center B subset (MS4A1 NEIL1 )
- two plasma subsets plasma B (MZB1 CD38 )
- dividing plasma B (MZB1 CD38 MKI67 ).
当然了，每个亚群各自特异性基因表达量也可视化成功。
更有意思的是，在群里跟大家交流后，提问的小伙伴居然恍然大悟，原来是他自己本来就是看过这个文献。但最开始仅仅是在朋友圈浏览了中文介绍，自己也是下载了原文pdf也是匆匆一瞥。
问题在于
没有记录笔记，其实这样的文献对我们的价值并不大，我们能用到的就是降维聚类分群和各个细分亚群标记基因啊！整理起来也非常容易，但是做过就是做过，比匆匆一瞥好太多了。
