肿瘤内异质性对癌症患者的准确诊断和个性化治疗策略的制定提出了重大挑战。此外，这种异质性可能是治疗耐药性、疾病进展和癌症复发的基础。虽然免疫疗法可以获得很高的成功率，但选择压力加上肿瘤内部的动态进化推动耐药克隆的出现，使肿瘤在某些患者中持续存在。为了提高免疫疗法的疗效，研究人员已经使用空间转录组技术来识别并随后阻断肿瘤异质性的来源。
原位杂交
原位杂交(ISH)是一种使细胞或组织中特定DNA或RNA分子可视化的分子技术。ISH是基于DNA/DNA或DNA/RNA双链的互补性，将标记的核酸探针原位杂交到目标上。通过这种方式，我们可以获得有用的空间信息。
荧光原位杂交
FISH是检测微生物、诊断实体瘤和血液瘤以及指导癌症治疗的有效临床工具。例如，FISH通常用于检测慢性髓系白血病中的BCR-ABL1 t（9；22）易位和各种癌症中的许多融合基因。FISH还被用于确认乳腺癌中HER2基因的扩增，从而确定最有可能受益于曲妥珠单抗（一种抗HER2的单克隆抗体）治疗的患者。另一个重要的例子是在非小细胞肺癌中检测EML4-ALK融合基因。随着越来越多的免疫疗法被开发和批准，研究人员试图用FISH来预测癌症免疫治疗的反应性。为了扩大FISH的有效性，可以将FISH与IHC或IF结合起来，同时检测不同细胞类型的RNA和蛋白质，以更好地表征肿瘤微环境（TME）。
smFISH和RNAscope
为了解决传统FISH的局限性，研究人员从研究DNA转移到研究单分子RNA，并采用高通量的方法，由此产生了smFISH技术，其能够可视化和量化单个mRNA分子，并表征内源性基因表达的空间模式。通过靶向细胞mRNA而不是DNA分子，smFISH已经成为评估肿瘤内转录异质性的有力工具。
RNAscope是一种商业化的基于ISH的技术，可以检测多达12个不同的RNA靶点，并且可以方便地与IHC和/或IF结合，以自动化的方式同时研究RNA和蛋白质。相对于其他基于FISH的技术，RNAscope已经设计了13000个以上的RNA探针，并通过商业化的流程进行验证。因此，它是一种用于基础研究和临床实验的省时和友好的方法。RNAscope已经广泛应用于各个学科，包括传染病、癌症、免疫治疗、炎症和神经科学。特别是，它是IHC的一种强有力的替代方法，可以评估各种实体瘤中免疫检查点的表达，如PD-L1。通过检测特定RNA，RNAscope阐明了TME、免疫逃逸机制以及新的预测和预后癌症生物标志物。
在免疫疗法的背景下，RNAscope在理解CAR-T细胞疗法方面发挥了宝贵的作用。RNAscope已被用于评估靶基因表达的特异性，并跟踪CAR-T细胞在异种移植小鼠模型中的分布。扩展到人类样本，已有研究验证了BCMA的表达是多发性骨髓瘤CAR-T细胞免疫治疗的靶点。
Multiplexed smFISH
尽管可以从RNAscope等技术中获得更高的灵敏度和特异性，但最终需要基于FISH的技术，允许进行高通量转录组分析，以更好地表征显示独特基因表达谱的稀有细胞群和细胞类型。MERFISH和seqFISH，不仅提供了改进的RNA定量、信号放大和检测，而且提供了基于图像的转录组分析。
MERFISH从smFISH改良而来，采用了基于条形码的组合标记方法，然后进行多轮杂交，以确保荧光信号的高亮度和一次可检测到的大量RNA。
MERFISH原理seqFISH是另一种基于连续几轮条形码杂交标记的Multiplexed smFISH技术。例如，seqFISH被用来对小鼠胚胎干细胞和脑组织中>10000种mRNA进行成像，具有较高的准确性和分辨率。相关研究已证明seqFISH是研究和获得T细胞成熟过程中调控基因表达动态的有力工具。另一项研究将微流体技术与Multiplexed smFISH技术结合起来研究乳腺癌中的肿瘤异质性证明，Multiplexed smFISH可以从不同角度进一步优化。
尽管smFISH技术前景广阔，但由于探针设计、验证、图像分析和解码的复杂性，基于smFISH的复合技术尚未广泛应用于转化研究或临床应用。使用非多重FISH、定量PCR、IHC和IF在mRNA或蛋白质水平上研究单个基因的表达通常更为方便，尤其是当研究的基因数量较少时，如一组预后标志物。另一个限制是，由于序列杂交的性质，总成像时间加起来至少为18小时，还不包括最初的36~48h的探针杂交时间，因此与其他技术相比（如DSP和Visium），总体通量较低。此外，Multiplexed smFISH技术只能评估新鲜冷冻组织中一种类型的分析物，如RNA。新兴的技术如DSP，可以评估新鲜冷冻组织和病理学常规使用的标准福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织中的蛋白质和RNA。
不同成像方式的概述和比较DSP
DSP是一种高复杂度的空间分析方法，其克服了Multiplexed smFISH技术的主要限制。DSP使用寡核苷酸检测技术来量化FFPE组织样本中的蛋白质或RNA。
用于RNA靶标检测的DSP原理与顺序杂交技术（如MERFISH）不同，DSP提供了更高效的工作流程，可在48小时内从10~20个组织切片或多达384个目标区域产生结果。此外，与只分析RNA的Multiplexed smFISH相比，DSP可以同时检测96种蛋白质或1400个mRNA。这一特征与癌症免疫治疗特别相关，因为mRNA和蛋白质表达模式的差异可用于阐明转录后调控和翻译后修饰，从而导致蛋白质不稳定，影响预后和治疗反应。同时，DSP还保存了组织样本的完整性，可以储存珍贵的样本，并用于将来的进一步分析。
DSP在免疫治疗领域有着广泛的应用，例如已有研究用DSP评价了接受化学免疫治疗的弥漫性大B细胞淋巴瘤患者的免疫微环境；DSP在免疫检查点阻断治疗方面也有研究，包括抗PD-L1和抗PD-1治疗。DSP可以作为一种辅助诊断工具，对TME中空间定义的区域内PD-L1蛋白表达进行标准化、定量和客观评估。在另一项研究中，DSP成功地识别了20种以上的生物标志物，这些标志物可以预测黑色素瘤患者对免疫治疗的反应。
空间转录组技术（ST）
在单细胞RNA测序过程中，由于组织通常被均质化以获得转录组的平均概况，造成空间信息丢失。最近，空间转录组技术（Spatial Transcriptomics）被开发，该技术利用空间条形码寡脱氧胸腺嘧啶微阵列实现完整组织切片中的转录组定量可视化和分析。
这项新技术首先在小鼠嗅球上得到证实，并遵循如下标准工作流程：组织切片、固定、苏木精和伊红（H&E）染色、亮视野成像、组织渗透、cDNA合成、组织切除、探针释放、文库制备、测序、数据处理、数据可视化和分析。
通过ST对乳腺癌、前列腺癌和皮肤恶性黑色素瘤活检的数据分析显示，肿瘤内和肿瘤间的异质性达到了前所未有的水平，以及通过RNA测序分析和/或标准形态学注释，注释肿瘤区域和外周之间的基因表达谱存在明显差异。此外，利用这种技术进行的体内实验已经发现了通过重新增殖小胶质细胞诱导IL-6信号，这在治疗方面可能有价值。
为了利用ST的潜力，研究人员最近开发了一种称为MIA的分析方法，其整合了单细胞RNA测序和ST技术产生的数据集，将细胞定位到组织上特定的区域。作为概念证明，MIA是在胰腺导管腺癌的数据集上进行的，并且揭示了特定的细胞类型和亚群在空间限制区域的富集，这些区域以前是未知或不可检测的。
基于空间转录学的概念，10× Genomics发布了Visum空间基因表达解决方案，与ST技术的第一次迭代相比，它具有更高的分辨率和更高的灵敏度。其被用于深入研究与组织结构和功能相关的疾病，除了用于癌症免疫治疗外，还可以用于神经系统疾病。
Visium空间基因表达解决方案原理尽管转录空间分析技术相对较新，但在肿瘤免疫治疗中已被广泛探索。FISH和RNAscope是诊断和预测实体瘤和血液瘤的有效临床工具。较新的技术，如MERFISH和Visium，通过前所未有的分辨率和灵敏度实现批量转录组分析。这类技术的可获得性不断增加，能够发现新的生物标记物，用于预测免疫治疗的反应，并允许基于其独特TME的异质性的个性化治疗方法。这些空间分析技术还可能与降维技术相结合，例如UMAP用于可视化TME的免疫景观。
显示组织样本中UMAP和缺氧梯度的示意图展望未来，DSP提供了mRNA表达的空间分析和数字表征，但仍然受到可同时研究的基因靶点数量的限制。尽管Visium在市场上相对较新，但其在短时间内不断改进，在疾病病理学和临床转化研究方面有着巨大的潜力。
研究人员可利用各种不断发展的空间转录组技术，重要的是既要考虑技术特征，包括空间分辨率、敏感性、特异性和组织类型，又要考虑实际因素，如成本，与可用资源的兼容性和周转时间。研究人员必须仔细考虑其研究问题，并选择一种与其研究和临床目标密切相关的适当技术。
首发公号：国家基因库大数据平台
参考文献
Nerurkar S N, Goh D, Cheung C C L, et al. Transcriptional Spatial Profiling of Cancer Tissues in the Era of Immunotherapy: The Potential and Promise[J]. Cancers, 2020, 12(9): 2572.
图片均来源于参考文献，部分信息来源于“伯豪生物”公众号，如有侵权请联系删除。
