英文标题： Assessment of microbial α-diversity in one meter squared topsoil
中文标题：
估计1m2表层土中的微生物α多样性
杂志：
Soil Ecology Letters, 2021
第一作者：
厉舒祯
通讯作者：
邓晔
作者单位：
Key Laboratory of Environmental Biotechnology, Research Center for Eco-Environmental Science, Chinese Academy of Sciences, Beijing
Graphical abstract
背景
物种数量（richness）是群落α多样性最基本的指标，也是后续分析的基础。
但是目前我们对于微生物数量的估计还存在很大的偏差，且研究主要集中于大尺度。
相较而言，小尺度易于彻底采样，能够得到较为准确的物种数量，还可为后续研究提供基础。
得益于高通量测序技术和相关分析方法的发展，我们可以通过多种方法对小面积微生物数量进行估计。
实验
在内蒙古多伦县采集了半干旱草原表层土壤（0-20 cm）样本 (Figure 1)。
具体采样设计见前文：
STOTEN：不同采样方法对微生物群落α多样性的影响
一共4个样方，每个样方得到了141个重复样本的16S rRNA基因测序数据，超过1千万条合格序列。数据分析在（http://mem.rcees.ac.cn:8080）进行。
采用三种聚类方法：UPARSE 97% cutoff; Deblur; DADA2进行物种聚类，并分别采用非渐进的外推法、非参数的渐进法和Scaling law估计了样方中原核生物的物种数量。
Figure 1 采样设计 (a) 单个样方的33个样本. (b) 四种混样方法.
主要结果
1. 非渐进的外推法
基于iNEXT实现了内插与外推曲线(Figure 2)。观测物种数为24,921±634 (UPARSE), 52,578±1,919 (Deblur), 15,699±610 (DADA2)。估计的物种数为27,137±487 (UPARSE), 56,527±1,170(Deblur), 15,809±613(DADA2)。观测数与估计数已基本一致。
假定此方法估计的物种数为理论物种数，在此基础上，需要超过50万（UPARSE，Deblur）和100万(DADA2)条序列才能检测到~50%的物种（Table 1）。这个数字远远超过了目前大多数研究对一个样本/样方测序的深度。目前通常以1万-5万条序列进行高通量测序会忽略大部分的稀有物种。
Figure 2 (a) UPARSE, (b) Deblur, and (c) DADA2的稀释和外推曲线.
2. 非参数的渐进法
采用了基于丰度(Chao1, ACE and Jack1)和发生率(Chao2, ICE and Jack1)的非参数方法相互印证，来估计物种数量（Table 2）。三种方法分别为27,193±1,076（UPARSE）, 56,985±2,347（Deblur）, 18,215±3,789（DADA2）。和非渐进的外推法比较一致。
类似的，我们暂且把这些值作为理论的物种数。我们发现测序深度显著影响着非参数方法的结果。如当测序深度为100万时，非参数方法得到的估计值也只能达到理论物种数的70~80%。
因此，目前基于扩增子测序使用非参数方法估计的物种数也显著低于真实值。
3. 尺度定律估计
我们还使用Locey and Lennon et al.建立的尺度定律进行了预测。平均结果比UPARSE,Deblur, DADA2分别高了36, 17, 61倍。表明尺度定律应用在1m2这样的小尺度上可能会带来偏差。
4. Hill number
使用Hill number考察了高阶多样性的变化。发现在阶数q>1时多样性基本收敛。
Fig. S4 (a) UPARSE, (b) Deblur, (c)DADA2方法的Hill numbers.
5. 不同的序列聚类算法对微生物物种的估算具有较大的影响。不同算法在序列去除和聚类原理上有较大的区别，而选择聚类算法应考虑精确性和覆盖度的平衡，以及所涉及生态学问题的特殊性。
这项研究为我们理解较小面积中的微生物物种数量提供了基础，同时也为区域、景观、生态系统尺度的微生物多样性提供了支撑。
