了解肿瘤异质性——肿瘤内细胞间的分子变异——有望解决癌症生物学中的突出问题，并改善特定癌症亚型的诊断和治疗。近日，来自澳大利亚的科研团队在《Nature Methods》发表综述文章，总结了空间技术在肿瘤研究中的应用，并讨论了目前的方法和未来的机会，以计算整合这些模式实现对肿瘤生物学的综合评估。
空间癌症生物学领域的突出问题空间技术在肿瘤研究中的应用
研究团队总结了三个主要领域：（1）用于跟踪癌症亚克隆和肿瘤结构变化的光学条形码方法；（2）用于检测特定生物标记物的空间蛋白质组学方法；（3）用于探索肿瘤及其微环境中细胞的空间转录组学方法。
克隆、空间转录组学和蛋白质组学方法时间表 使用光学克隆条形码追踪活细胞的时空命运
传统上，通过使用DNA和RNA测序来探索癌症在亚克隆分辨率下的进化进程（包括一群细胞的混合测序和最近使用的单细胞测序）。虽然在测序前对肿瘤进行显微切割和分割，提供了关于亚克隆在其微环境中的三维（3D）分布信息，但越来越需要基于单细胞分辨率的成像方法来观察克隆的相互作用。
这些荧光光学条码技术（又称多色克隆谱系追踪）使用多个荧光报告因子的随机和多重表达来识别和追踪众多亚克隆。两种主要方法涉及（1）随机和组合表达转基因的体内表达（转基因模型例如在Confetti小鼠中）或（2）在移植到受体小鼠之前，对癌细胞进行体内慢病毒感染以表达不同的荧光蛋白（异位模型例如使用LeGO载体）。通过这些转基因的构成性或诱导性表达，荧光细胞及其后代的时空命运在特定器官或整个动物中被纵向研究。虽然光学谱系追踪方法可直接显示体内克隆性癌症的异质性，但可识别颜色的数量以及可追踪的亚克隆数量是有限的。
使用LeGO载体异位表达多种荧光蛋白，可以在各种细胞类型和物种中进行谱系追踪光学条形码技术的最大优势在于进行活细胞和活体成像，并获取单个细胞及其所属亚克隆的动态信息。为了充分利用这一优势，必须在体内3D组织环境中的特定细胞与其分子组成之间建立直接联系。虽然光学标签有助于在分子分析之前通过流式细胞术对条形码细胞进行分类，但这需要细胞分离，从而导致单个细胞的准确组织位置丢失。为了将亚克隆的三维可视化与有意义的分子信息联系起来，将原位可视化与空间转录组学或蛋白质组学技术相结合的方法将在发现癌症亚克隆行为的新调节因子方面具有非常重要的价值。
在空间环境中增加可检测蛋白质数量的新策略
组织学分析对于肿瘤的定性至关重要。病理学家通常使用苏木精和伊红（H&E）染色来进行诊断和预后。虽然仅根据H&E进行肿瘤分类的深度学习模型的开发成本很低，而且可以进一步利用这一信息，但这些方法提供的肿瘤和TME的概况信息有限。随着对肿瘤异质性和TME中细胞多样性认识的增加，增加空间上可分辨的蛋白质数量的需求也在增加。免疫荧光通常可以在一个完整的组织切片内对四或五个蛋白质目标进行多重检测。然而，最近的方法能够评估几十种蛋白质标记物，并能提供一个更全面的肿瘤及其微环境图谱。这些方法涉及抗体染色和检测的连续循环，使用元素同位素结合抗体池或使用荧光显微镜或DNA测序检测的DNA条形码抗体进行染色。
空间蛋白质组学方法研究团队在文中展示了一些新兴技术的选择（所有方法都需要对特定的抗体组合进行优化，同时要考虑到组织的类型和质量）。
> 迭代方法通过使用连续几轮的抗体或标签检测来增加蛋白质目标的数量，例如mIHC、OPAL；其他方法通过更温和地去除或剥离抗体标签而不是抗体本身来减少循环对组织完整性的影响，例如cycIF、REAdye_lease技术；其他迭代方法使用一组与DNA条形码结合的初级抗体进行单步染色，例如CODEX。
基于荧光的方法提供高分辨率的空间信息，但光谱重叠限制了可以同时成像的荧光团的数量。使用非荧光的方法（例如质谱和测序）避免了这个问题，并且可以在一个染色和扫描步骤中测量多达100种蛋白质。
> 基于质谱技术的免疫检测。飞行时间（TOF）质谱技术可以检测与稳定金属同位素结合的抗体。与基于荧光的方法相比，检测器的质量分辨率允许同时检测几十个金属标签而不受干扰。飞行时间质谱流式细胞术（CyTOF）基于这种形式的免疫检测，能够对多个参数进行单细胞分析。IMC使用与CyTOF相同的TOF读数，结合高能量、短波长的激光束进行组织消融，聚焦到直径为1μm的光斑大小。类似的方法使用聚焦离子束和二次离子质谱来实现更高的分辨率和灵敏度。与IMC相比，MIBI可以在FFPE组织中成像40多种蛋白质。IMC或MIBI扫描组织区域的时间比循环方法长。然而，不需要进行抗体染色和成像周期（如mIHC或OPAL）或重复DNA杂交轮次（如CODEX）。
> 基于测序的免疫检测。蛋白质和RNA的多重数字空间分析（DSP）利用寡核苷酸结合的抗体，使用 NanoString nCounter 时，DSP可以同时检测至少20~100种蛋白质，并可能对 RNA、DNA 和蛋白质进行多达800-plex的检测，使用高通量测序时甚至可以进行更高的多重检测。尽管分辨率有限（最近空间分子成像仪平台有所改进），DSP已成功用于研究转移性前列腺癌的肿瘤异质性。
单细胞分辨率下的多重蛋白质检测为定义肿瘤异质性和TME的复杂性提供了新的机会。基于蛋白质的技术是非常宝贵的，因为它们提供了一个直接的功能信息测量。这些技术的进一步完善和商业化将提高通量（如已经出现的自动染色机和玻片扫描仪），并实现更好的亚细胞分辨率和三维成像。然而，肿瘤细胞固有的可塑性导致了一系列的细胞亚型和状态，只有与健康组织相比，通过广泛的标记物分析才能确定。空间转录组方法为蛋白质组分析提供了补充数据，获得了关于肿瘤复杂性的综合视角。
空间转录组技术及其应用
研究团队从基于FISH和基于测序两方面介绍了空间转录组技术。
基于FISH的空间转录组技术
基于测序的空间转录组技术空间转录组技术详细解读：
