美国华盛顿大学的David Baker教授研究组的Parisa Hosseinzadeh开发了一种新型的基于结构从头设计环状多肽的通用方法，该方法利用了已知与感兴趣的靶表面结合的分子中的官能团作为锚，使用Rosetta软件中的广义运动闭环方法围绕该官能团构建环肽。成功设计出高活性的环肽结合剂。相关工作于2021年6月7日发表在Nature communications期刊上，名为“Anchor extension: a structure-guided approach to design cyclic peptides targeting enzyme active sites”。他们将这种设计方法命名为“anchor extension”。并使用该方法设计出针对组蛋白去乙酰化酶(HDAC2和HDAC6) 设计了IC50为9.1nM以及4.4nM的两个高活性环肽分子，相对原始的化合物分子活性提高了近1000倍。
——研究背景——
近些年，多肽正在成为一类非常具有应用前景的药物，有可能结合很难用小分子结合的蛋白质表面，环肽因其可调的刚性、稳定性和药代动力学性质而受到特别关注。基于多肽文库的肽发现方法已被用于获得以高亲和力结合到蛋白质界面的分子。然而，由于合成的限制，对整个化学空间进行采样几乎是不可能的，并且这些文库仅限于氨基酸的子集，这些子集通常与热点蛋白质表面的生化特性息息相关。
基于结构的多肽结合剂的设计更加具有挑战性，目前的大多数方法首先需要有目标蛋白和结合蛋白的共晶结构，然后截取结合蛋白上对结合稳定性贡献较大的片段，有些工作会继续进行后续的序列优化来增强结合强度，最后得到结合强度较高的多肽结构。这些做法的缺陷主要分为两方面，首先是对具有结合配偶体的共晶体结构的要求限制了这些方法的应用，因为对于许多靶蛋白来说，没有这样的结构可用，局限于已知的结合配偶体也显著减少了可靶向表面的范围。此外，大多数蛋白质-蛋白质相互作用涉及相当大的埋藏表面积，设计好的多肽只能跨越该表面的一部分，因此结合能力会减弱。
——设计方法——
本工作选取HDACs家族作为验证算法的靶点，HDACs家族结构数据丰富，容易通过酶抑制的方法测结合，并且HDACs家族晶体简单易得，有益于后续的实验验证。HDACs作为潜在的药物靶点，具有非常丰富的极性表面，对环肽binder的设计而言是一个挑战，并且与HDACs具有结合活性的天然小多肽有很多，可以作为最后的测评的baseline。
本文选取SHA（2S-2-amino-7-sulfanylheptanoic acid）来做初始的anchor结构，原因是SHA中的硫原子能与催化活性中心的Zn选择性共价结合而抑制酶活。机理如图所示（通过动力学模拟解析出SHA的活性构象以备之后使用）：
图1：Anchor结合位点示意图
设计方法主要分为三轮：
（1）环肽结构嫁接：
首先人工设计了200种刚性环肽结构，加上实验室解析出的两个环肽结构，分别与SHA与HDACs结合的活性构象进行结构叠合的嫁接操作，筛选出与酶活性中心产生空间位阻最小的个体，并且通过序列设计尽可能地提高环肽与HDAC2活性中心的形状互补并且优化弱相互作用。最终筛选得到IC50为289 nM的环肽个体：des1.1.0（单体名称，“1.1.0“三个数字分别代表第一轮设计、筛选出的第一个单体、没有进行突变实验）。
图2：第一轮设计结果示意图
（2） 人工理性设计Anchor：
基于第一轮设计的经验，收到第一轮设计的HDACs抑制剂构象的启发，观察到活性中心附近有较大的疏水面，并且很多设计结果中会出现芳香环与疏水面作用的情况，作者尝试使用在SHA上增加了一个Trp残基来模拟类似的芳香环，扩张了Anchor作用范围，增强了作用强度。des1.1.0中作者还发现环肽分子在结合到酶活中心区域还与两个水分子有氢键相互作用，除去水分子在能量上是不利的，并且这两个水分子在其他HDACs的晶体结构中也有发现，因此在本轮的设计中额外考虑两个结构水分子的影响。然后进行基于热点残基的环肽设计，最终从100个设计的分子中筛选出了IC50为49.3nM的候选物(des2.1.0)，相对于刚性环肽设计方案活性提高了四倍，在后续实验中，通过突变设计，成功地进一步提升了环肽(des 2.1.1)的抑制活性至16nM。
图3：第二轮设计方法及结果示意图（b中绿色部分为结构水）
（3） Anchor分子上邻域采样以获得高结合活性和选择性：
在上述的设计结果中，环肽分子并没有对HDAC2和HDAC6之间有很强的选择性，原因是HDAC2上有疏水平面，而设计的分子并没有与疏水平面形成很好的相互作用，针对这一点，作者针对Anchor分子上邻域的残基进行采样，得到最大化疏水相互作用的结构，作为新一轮设计的初始构象。
图4：第三轮设计方法中采样部分示意图
采样方式有两类：第一类只采用Grid搜索(design3)，第二种Grid搜索后进行relax(design4)。这两种方法设计出来的环肽有更好的形状互补特性。采样得到十万条序列，从中筛选出22条打分更优的序列。其中13条多肽的IC50活性低于100nM，des3.3.0的IC50为9.1nM。除此以外还发现了另外一个设计des3.3.2（design3）对HDAC2的选择性是HDAC6的6倍。
图5：第三轮设计方法两种采样方式的结果示意图，abcd代表design3，efgh代表design4
design 4得到的多肽均更加倾向于与HDAC6特异性结合，晶体结构解析显示多肽在结合状态与设计时的结构有较大不同。
图6：设计效果总览（左：设计个体与HDAC2和HDAC6结合的IC50对比图；右：Rosetta打分与 RMSD对比图）
——小结——
本文作者通过比对了多种环肽设计的策略和方法，成功地设计出了一系列具有高抑制活性的环肽分子，这类分子有着较高的柔性。Anchor extension为靶向设计结合的环肽提供了新的思路，通过计算设计，实验验证，结构解析，突变优化等流程是设计高活性环肽分子的有效途径。但是环肽分子设计中仍存在选择性不好的问题需要解决。
参考文献：
Hosseinzadeh, P. et al, Anchor extension: a structure-guided approach to designcyclic peptides targeting enzyme active sites. Nature Communications 12, 3384 (2021).
DOI：10.1038/s41467-021-23609-8
