单细胞测序中小鼠肝脏组织细胞悬液制备流程

背景介绍

肝脏，是脊椎动物身体内以代谢功能为主的一个器官，并在身体里面充分扮演着去氧化，储存肝糖，分泌性蛋白质的合成等。肝脏是由肝细胞组成，肝细胞极小，肉眼看不到，必须通过显微镜才能看到。人肝约有25亿个肝细胞，5000个肝细胞组成一个肝小叶，因此人肝的肝小叶总数约有50万个。肝细胞为多角形，有6-8个面，不同的生理条件下大小有差异，如饥饿时肝细胞体积变大。每个肝细胞表面可分为窦状隙面、肝细胞面和胆小管面三种。

肝脏的主要连接成分主要是结缔组织，因此我们选择使用胰蛋白酶对肝脏进行第一轮解离，枯草芽孢杆菌蛋白酶可水解天然和变性蛋白，并且在碱性条件下具有活性。我们使用其对肝脏组织进行进一步解离。

为了保存小鼠肝脏完整的基因表达谱，我们将成年小鼠肝脏置于冰上进行解离。小鼠肝脏第一层由0.25%胰蛋白酶在4℃下离解离10min，第二层解离由添加地衣芽孢杆菌酶，胶原酶及DNase I 组成的混合酶。解离产率为5000cells/mg，存活率大于等于93%（以AO/PI计数为标准）。

一. 实验试剂及耗材

表1. 小鼠肝脏组织解离部分试剂耗材参考表

二. 实验步骤

1. 在预冷的组织保存液中保存及运输组织，配制酶解离液，置于冰上待用，离心机调整至 4℃ 预冷；
2. 将放有你1/2 体积 DPBS 的培养皿置于冰上，使用无菌的剪刀及镊子剪切组织直至糊状；
3. 使用 DPBS 对剪切的组织进行过筛清洗；
4. 离心管中每30 mg肝组织中加入1 mL 胰酶 ，通过摇晃离心管重新悬浮组织颗粒，在室温下静置10 min。
5. 在离心管中加入5mL预冷的DPBS，稀释胰蛋白酶混合液，终止消化。
6. 在离心机中使用250g 4℃ 离心5min后，除去上清液；
7. 在离心机中加入4mL预冷的DPBS重悬细胞核组织，在冰上沉淀40s 大组织块沉降（此时释放的细胞留在上清液中）。
8. 将收集的上清液（含细胞）通过40µM细胞筛过滤，去除结团细胞及组织块；
9. 过滤后的细胞悬液通过4℃ 300g离心 5min 收集；后再使用0.5 mL的PBS （含1% BSA）重悬细胞，置于冰上保存。
10. 将步骤 7 中剩余的组织块加入组织解离酶（5mg/mL，胶原酶 IV 0.8mg/ml，DNase I 0.5mg/ml），置于37℃ 的摇床上 80rpm/min进行解离；
11. 消化 8-12min之后，加入两倍体积的 DPBS稀释终止消化，取出离心管，涡旋仪上，轻微涡旋2-3次（2S/次）。
12. 将终止消化后的酶及细胞混合物分别通过 70μm和40μm的细胞筛，下清液离心收集细胞。
13. 在4°C下旋转300 g 离心5 min，除去上清液，使用DPBS（含1% BSA）重悬细胞，置于冰上备用。
14. 将步骤9 ，步骤12中的细胞4°C下旋转300 g 离心5 min离心收集，弃上清；加入1-4mL红细胞裂液，置于冰上3-5min裂红。
15. 裂红结束后加入等体积的DPBS, 在4°C下, 300 g 离心5 min 收集细胞，弃除裂红液；
16. 使用0.5% BSA的DPBS重悬细胞，离心收集，弃上清，而后用含有0.5% BSA的DPBS重悬细胞，用AO/PI染料染色计数。

三. 结果及注意

注意：肝脏组织中杂质及碎片较多，且肝细胞容易破裂；所以解离过程中要注意根据实际情况适当下调。富集细胞时的离心力，为达到彻底清洗碎片和杂质的目的，在解离过程中使用的解离酶浓度和强度不宜过高，获取的单细胞悬液如果用于单细胞测序，则需要在获取细胞悬液之后尽快进入下游建库，避免因细胞破裂引入RNA 污染问题，从而影响测序数据质量。