本protocol仅供参考，还请根据自己的组织和实际的实验设计进行相应的替换
背景介绍
结肠是大肠的一部分，主要功能是吸收水分和电解质，将食物残渣形成粪便。结肠组织学结构包括黏膜、黏膜下层，肌层和外膜。黏膜表面光滑无绒毛，上皮为单层柱状，由吸收细胞和杯状细胞组成；黏膜下层则是结缔组织，含成群脂肪细胞；肌层由内环形和外纵行两层平滑肌组成，可形成结肠袋；外膜为浆膜或者是纤维膜。
在本实验中使用到的TrypLE™ Express 是一种非动物源性重组酶，用于各种粘附状态下的哺乳动物细胞，包括 CHO、HEK293、A529、角质形成细胞和胚胎干细胞。TrypLE™ Express 裂解赖氨酸和精氨酸 C-末端上的肽键，可直接替代胰蛋白酶，特异性高，细胞损害小。
结肠组织图片及示意图
实验仪器及耗材
转移培养基(500 mL)
- DMEM(高葡萄糖)500mL 青霉素/链霉素5mL HEPES 5mL(1M)
HPGA (500 mL)
- HBSS 500 mL 青霉素/链霉素5 mL HEPES 5mL(1M)
洗涤培养基(50 mL)
- HPGA 1mM EDTA 1mM DTT
螯合培养基(50 mL)
- HPGA 1mM EDTA
实验步骤
- 10mL预冷洗涤培养基清洗得到的组织，重复3次。
- 清洗后的组织转移到37℃预热的螯合培养基（5mL）中孵育20分钟，每10分钟晃动一下组织。
- 去上清，将组织转移到5mL预热的螯合培养基中，37℃孵育10分钟。
- 震荡2次，每次5秒。
- 解离组织自然沉淀，取上清，剩下的组织再加入5mL预热的螯合培养基，37℃孵育。
- 收集到的上清液如果有隐窝存在，则4℃，300g离心4分钟。
- 使用2mL转移培养基重悬隐窝，冰上保存。
- 重复步骤3到步骤7，尽可能收集隐窝，重复至多4次。
- 隐窝悬浊液，4℃，400g离心4分钟。
- 用3mL预热的TrypLE Express（含50μg/mL 脱氧核糖核酸酶I）重悬。
- 37℃孵育45分钟，摇动或者晃动都可。
- 用含5%血清的3mL转移培养基终止。
- 用70μm细胞过滤器(用血清润洗)过滤到50mL离心管中，用5mL转移培养基 5%血清冲洗细胞过滤器。
- 除去过滤器，用含5% 血清的15mL转移培养基清洗。
- 300g离心4分钟。
- 去除上清。用10mL洗涤培养基清洗沉淀。
- 300g离心5分钟。
- 非常小心地取出上清（不要碰到沉淀颗粒），直到剩下1mL。重悬沉淀。
- 用40μm细胞过滤器(用血清润洗)过滤，用5mL PBS 0.04% BSA冲洗。
- 300g离心5分钟，去上清至小于1mL，重悬沉淀后用PBS 0.04% BSA补到1mL。
- 通过细胞计数仪检测细胞活性大于等于85%，背景干净，结团率小于5%，细胞量大于等于5万；可用于后续单细胞测序建库实验。
制备结果
注意：结肠组织脂肪含量高，要多清洗，清洗不完全会干扰细胞计数，严重会影响细胞捕获。解离过程中容易结团，一定要充分消化。另外，结肠组织代谢比较旺盛，解离的时间和酶的强度把握不好的话，活率容易偏低，即使合格了最后下机数据可能线粒体偏高。
