00 文章信息
「英文标题：Identification of the tumour transition states occurring during EMT」
「中文标题：识别EMT期间发生的肿瘤转移状态」
「期刊：」《Nature》
「影响因子：」 42.778 「发表时间：」 2018-04-18
「研究领域：」 单细胞
「DOI号：」 10.1038/s41467-018-03867-9
01 文献概述
SUMMARY
02 文章背景
- 在癌症中，上皮-间充质转化（EMT）与肿瘤干细胞的转移和对治疗的抗性有关。最近有人提出，EMT不是一个二元的过程，而是通过不同的中间状态发生。然而这个设想没有直接的体内证据。本次研究中，我们在皮肤和乳腺原发肿瘤中筛选出大量的细胞表面标志物，并鉴定出不同EMT阶段相关的多个肿瘤亚群的存在：从完全上皮化到完全间充质细胞状态以及中间混合状态。虽然所有的EMT亚群呈现相似的肿瘤增殖细胞能力，但它们在细胞可塑性、侵袭性及转移潜能等方面均表现出差异。他们的转录和表观遗传表现识别潜在的基因调控网络、转录因子和信号通路，控制不同的EMT过渡状态。最后，这些肿瘤亚群分布在不同的位置，对EMT过渡状态有不同的调节作用。
- 目前尚不清楚EMT是否在体内通过这些中间状态进行，是否存在多少中间步骤，这些中间状态如何可塑性和可逆性，哪些机制调节从一种状态到另一种状态的转变，以及这些不同状态的含义是什么
03 实验流程
整个文章基于两种老鼠模型：
- a genetic mouse model of skin squamous cell carcinoma (SCC)
- K8CreER/Pic3caH1047R/p53fl/fl and MMTV-PyMT breast tumours
数据下载
单细胞针对的是 scRNAseq of YFP Epcam and Epcam- skin squamous cell carcinoma cells使用的是 SMART-seq建库方法，384孔板，共 383个单细胞数据。
- GSE110587 (RNA-seq and ATAC-seq)
- GSE110357 (scRNA-seq)
其实bulk测序包括：
GSE110584 | Identification of the tumour transition states occurring during EMT [ATAC-seq] |
|---|---|
GSE110585 | Identification of the tumour transition states occurring during EMT [RNA-seq] |
GSE110586 | Identification of the tumour transition states occurring during EMT [p63 overexpression RNA-seq] |
作者在GEO里面同时上传了自己分析好的表达矩阵，所以可以下载表达矩阵模仿一下作者的下游分析，比如如何找marker及分类。
单细胞把marker重新分类
单细胞转录组聚类结果
实验摸索EMT过程的5个形态
使用ATAC-seq数据来探索不同EMT中间态
04 实验结果
1. Different tumour EMT transition states
相比之下，一半标志物在YFP Epcam - TC中异质表达，表明EMT与细胞异质性有关
在EMT期间常异质表达的标志物包括CD61，CD51和CD106，这些标志物与肿瘤干性TCs亚群相关
在大多数(75%)混合瘤中，CD106、CD61和CD51可区分YFP Epcam−肿瘤中的6个不同的群体
在EPCAM 细胞比例较高的混合瘤中，约10%的肿瘤只有三重阴性(Epcam−CD51− CD61−CD106−)和Epcam−CD51 CD61 ，而仅有Epcam−的高度间叶性肿瘤有CD51 、CD51 CD61 、CD106 CD51 和CD106 CD51 CD61 三阳性亚群，几乎不存在三阴性和CD106 亚群
在所有TC中，Epcam表达的丧失与vimentin表达的增加相吻合，这与转换为间充质状态一致，表明在原发性皮肤肿瘤自发EMT期间鉴定出的亚群对应于具有不同EMT程度的不同肿瘤群体
PCA显示，PC1 可以解释21%的变异性，可以归因于EMT状态
单细胞水平上皮和间充质标志物的表达证实了上皮、间质和混合状态下EMT特征的逐渐获得，CD51、CD61和CD106标志物的分布与PC1上EMT的程度相关，证实了不同肿瘤亚群中发现的EMT梯度
细胞质蛋白免疫染色和 RT-PCR显示，从乳腺肿瘤分离的亚群呈现不同程度的EMT，与皮肤SCC相似，表明在EMT过程中，所鉴定的不同EMT过渡状态代表一种保守的机制。
在分化较差的乳腺癌，肺癌和食管癌SCC中检测到仅表达上皮标志物的区域，共同表达上皮和间质标志物的区域以及仅表达间质标志物的区域
这些数据表明，人类癌症中的EMT与不同的过渡状态（包括混合状态）相关，正如人类SCC的scRNA-seq那样
2. Stemness and plasticity of EMT states
EMT与癌症的干性有关，其特征是肿瘤增殖细胞(TPC)频率增加。Epcam - TC的TPC数量是Epcam TC的五倍。所有EMT亚群都呈现相似的TPC比例。不同EMT亚群间的增殖率无明显差异
由Epcam - TC移植引起的继发性肿瘤仅包含Epcam – TC
3. Metastasis of EMT transition states
三阴性和CD106 亚群比其他EMT亚群引起的转移要多。在乳腺化生样和MMTV-PyMT腔肿瘤中也观察到了混合状态的转移潜能的增加。数据表明，并不是所有的表达CD106的细胞亚群同样转移性; 它们的转移潜能与混合EMT状态的相关性大于CD106表达的水平。在小鼠模型中，大多数CTC经历了EMT，而大多数Epcam - CTC呈三阴性，进一步支持了混合EMT状态与转移潜力增加相关的观点。
虽然皮下注射EPCAM−细胞在继发性肿瘤中没有产生EPCAM TC，但当在肺部定植时，所有EPCAM−亚群都能够恢复到EPCAM TC，这表明即使是最极端的EMT状态也不是不可逆转的定在间质状态，并且可以在肺微环境中经历MET。然而，转移的数量与这些群体更大的MET能力并不相关，这表明除了MET之外的其他机制也有助于这些混合群体更高的转移潜能。
4. Molecular characterization of EMT states
RNA-SEQ显示不同上皮标志物的表达水平，，从Epcam 到三阴性、CD106 和CD51 细胞，然后在CD106 CD51 、CD51 CD61 和三阳性亚群中保持很低的水平。相反，一些间质标志物随着Epcam表达的丧失而强烈增加(在三阴性细胞中)，并保持稳定，而其他EMT标记，如Fn1，Prrx1，Col3a1和Lox表现出明显的表达梯度，在三阳性细胞中表达最高。
RNA-SEQ数据的非监督聚类分析进一步说明了这一点
为了进一步描述不同EMT状态之间的潜在分子差异，我们对scRNA-seq数据进行了无监督聚类分析，确定了不同的肿瘤人群，包括上皮，混合和间充质人群。
单层和分支表达分析模型(BEAM)显示，从上皮状态到间质状态的转变分成两种不同的间质细胞命运，具有不同的基因表达特征，表明了EMT中转录异质性的程度。
(c) 鉴定上皮基因中的增强子例如Cdh1，这些增强子在第一个EMT过渡过程中丢失
(d) 上皮基因的染色质区域仍在混合群体中表达，例如在三阴性亚群中Krt14和Krt17表达，
(e) TC失去Epcam表达后，常见的Epcam - EMT基因的增强子区域，例如Vimentin和Zeb1，呈现相同的开放染色质区域
(f) 在EMT期间其表达连续增加的基因，例如Col24a1和Aspn，具有特定的染色质区域，这些区域随着EMT的进行逐渐变得更加开放
(g) EMT亚群之间的基因表达显示了与体内不同EMT状态相关的逐步且非常特定的染色质重塑
(h) 对染色质重塑的无偏聚类分析显示TC分为三类：Epcam 和三阴性、CD106 和CD106 CD51 、CD51 CD61 和三阳性
由AP1、ETS、TEAD和RUNX基序组成的共同核心基序在EMT或MET期间的每个过渡步骤中都高度富集染色质重塑
这表明在EMT或MET的每个过渡阶段，无论EMT的程度如何，都需要相同的转录因子来诱导染色质重塑。除了这些共同的转录因子核心外，特定的转录因子基序还与不同EMT过渡期的染色质重塑有关。
研究毛囊来源的SCC中不同的EMT亚群，在这些细胞中，ΔNp63的表达独立于EMT8。持续的ΔN-p63表达抑制了Epcam 到Epcam−的转换，大多数Epcam−TC在早期混合状态被阻断，这从与其他EMT亚群相比三阴性的增加中可见一斑
为了进一步挑战转化生长因子-β和Smad2在预测中的作用，我们在诱导癌基因表达后，给Lgr5Cre/ERKrasG12D/p53KO小鼠注射了识别转化生长因子-β1、转化生长因子-β2和转化生长因子-β3的泛封闭抗体。我们发现抗转化生长因子-β抗体加速了肿瘤的出现，这与转化生长因子-β的细胞抑制作用是一致的。
然而，这些肿瘤比对照小鼠的肿瘤有更多的分化表型，Epcam 和三阴性增加，三阳性减少。
5. Different niches of the EMT states
根据K14，vimentin 和CD61的表达，混合瘤可以根据肿瘤的不同部位被细分为不同的区域。
在区域4中，YFP TCs更具成纤维细胞性，不形成细胞间连接，不表达K14并均匀表达 vimentin 和CD61；
在Pik3ca / p53 KO和MMTV-PyMT乳腺肿瘤中也观察到了这些不同的区域，由上皮细胞，混合细胞和间充质细胞以及增加的血管形成和炎性细胞组成。
TCs的免疫浸润密度与趋化因子及其他促炎性和促血管生成分子的表达相关
为了确定巨噬细胞浸润在调节EMT进展中的功能相关性，我们评估了巨噬细胞耗竭对EMT肿瘤亚群比例的影响。在肿瘤发生过程中给予抗Csf1r和抗Ccl2阻断抗体可有效耗尽循环和肿瘤浸润巨噬细胞，并减少肿瘤形成；此外，它增加了Epcam 和三阴性TC的比例，并降低了三阳性TC的比例。
这些结果证明了肿瘤微环境和巨噬细胞浸润在调节EMT状态之间的过渡中的功能重要性。
05 延伸
1. EMT 背景知识
EMT，全称epithelial–mesenchymal transition，又称翻译为上皮间质转换，指的是上皮细胞在一些因素的作用下,失去极性及细胞间紧密连接和黏附连接, 获得了浸润性和游走迁移能力, 变成具备间质细胞形态和特性的细胞的改变。这种行为是可逆的。
EMT的概念最早是1982年由Green-berg和Hay提出。然而，长久以来，科学界对于EMT在肿瘤转移过程中的作用一直存在争议，主要是因为无法在体内观察EMT过程 。
胚胎发育与癌症发展中的细胞可塑性变化有着惊人的相似性，而这种可塑性变化受到上皮间质转化epithelial-mesenchymal transition （EMT）过程的调节。胚胎发育时期，上皮状态和间充质状态的细胞能够自由转化。
- 上皮间质转化（EMT）使得细胞具备转移和浸润特性。
- 其反向过程，间质上皮转化mesenchymal-epithelialtransition （MET）赋予了细胞极性变化并失去移动能力。
EMT会促发癌细胞从病灶分离，转移到其它部位，而MET导致癌细胞停留，并在停留处引起新的肿瘤。
在很长一段时间内，许多科学家都认为EMT过程对于肿瘤转移是一个必须条件，EMT过程能够剥夺细胞与邻近细胞紧密结合的能力，使细胞能够在全身范围内迁移。科学家们认为是EMT给了癌细胞“双腿”让它们能够脱离原位肿瘤，转移到其他部位形成肿瘤转移灶。
一、 首先介绍下，EMT发生常见的标志分子。
1.表达减少：E- cadherin，Cytokeratin，ZO-1。
2.表达增多：N- cadherin，Vinmentin，Snail1，Snail2，Twi st，MMP-2，MMP-3，MMP-9。
3.活性增加：ILK，Rho。
二．参与EMT过程控制的常见信号通路有：
1.TGF-β信号通路。
2.Wnt信号通路。
3.Notch信号通路。
4.SMAD信号通路。
5.PI3K-AKT-MTOR信号通路。
三. EMT过程有着复杂的调节网络：
表观遗传的调节
转录调节
选择性剪接
蛋白质的稳定
亚细胞定位
这些调节方式多样性使得EMT的调节往往不是线性的。此前，EMT调节过程中关于E-cadherin的转录，EMT转录因子SNAI1，SNAI2， ZEB1，ZEB1和 TWIST1等研究较多。
2. 上皮细胞黏附分子（EpCAM）
与普通血细胞相比,CTCs具有某些特殊的生物标志物,包括CTCs表面的上皮细胞粘附分子(Epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)
不同文献报道不一致：
- 在咽癌中Ep-CAM高表达与淋巴结转移密切相关，Ep-CAM表达越高，淋巴结转移发生频率越高
- 在头颈部鳞状细胞癌中，Ep-CAM在转移灶中表达比原发灶更高
- 在胃癌骨髓转移灶中的播散性肿瘤细胞Ep-CAM的表达较原发灶降低
3. 使用BD Lyoplate筛选表面标志物表达
BD Lyoplate™ 人类细胞表面标记筛选平台，利用流式细胞技术或免疫荧光染色技术，同时筛选242种细胞表面标记，帮助研究者快速得知细胞株或原始细胞在特殊培养环境或药物刺激之后会表达何种细胞表面标记，省去预测及证实假说所需花费的时间。筛选平台利用冷冻干燥技术使抗体可长时间保存，并以更经济实惠的容量将抗体保存在96孔板中，提供研究者更快速便捷的研究技术。
简易操作流程
筛选平台包含三个96孔板，每一个well均包含冷冻干燥单纯未结合的细胞表面标记抗体，经过回溶之后即可与细胞检验（例如：全能或已分化干细胞）作用，再加入二抗anti-mouse or rat Ig Alexa Fluor 647与之作用，利用流式细胞仪或荧光显微镜进行结果分析，荧光表达量高即代表侦探到此蛋白质表现。筛选平台利用Alexa Fluor 647荧光进行结果的判读，方便研究者分析会表达绿色或黄色荧光蛋白质的细胞株，空白的well可加入预测的其他表面标记抗体同时分析。
4. 定量磷酸化修饰组学
溴脱氧尿苷（5-溴-2-脱氧尿苷，BrdU）是用于鉴别增殖细胞的胸腺核苷的合成类似物。BrdU 标记既可以在体外进行，用以标记细胞系和原代细胞培养物，也可以在体内进行，用以标记活体动物的细胞。BrdU可融入重组 DNA，并且能用抗 BrdU 抗体检测出来。
进行 BrdU 标记之后，还需在固定和通透化之后进行 DNA 水解步骤（有时称为DNA 变性步骤），让抗 BrdU 抗体与 DNA 中的 BrdU 结合。
5. CultureCoat细胞侵袭试验
以下的基于96孔微量的检测设计成加快对趋化性有影响的化合物的筛选过程。细胞迁移检测测量穿越多孔膜的数量。细胞侵袭检测监测通过细胞外基质的运动，侵袭性迁移是细胞过程背后的基本功能，包括血管生成，胚胎发育，免疫反映，转移和浸润癌细胞等。细胞侵袭检测供应测量侵袭细胞响应于化学引诱物和（或）抑制化合物穿越由基底膜成分的屏障的程度的一个灵活的，标准化的和高通量的格式 细胞侵袭检测。这检测用于像Boyden小室的简化设计。设计有两个由过滤器分离的预涂BME或另外的细胞外基质组分的小室。细胞悬浮液被放置在上室，含有特定化学引诱物测试介质被放置在下室，同时孵化。细胞丛上室通过涂层过滤器迁移到下室。钙黄绿素 AM是用于测量细胞侵袭的。为从过滤器分离迁移的细胞，细胞分离/钙黄绿素AM被放置在下室。钙黄绿素AM被细胞内化，并且细胞内酯酶裂解乙酰甲酯（AM）部分。无AM的钙黄绿素有明亮的荧光，并用于中型曲线比能测量侵袭或迁移的细胞的数量。
