00 文章信息
「英文标题：Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes」
「中文标题：用患者来源的类器官来模拟稀有前列腺癌表型」
「期刊：」《Nat Commun》
「影响因子：」 12.121 「发表时间：」 2018 Jun 19
「研究领域：」 类器官
「DOI号：」 10.1038/s41467-018-04495-z
01 文献概述
SUMMARY
罕见肿瘤研究中的一个主要障碍是缺乏现有的临床前模型。目前研究神经内分泌前列腺癌的模型很少。
我们报告了来自四名患者的转移性病变的活检的肿瘤类器官的产生和特征。我们证明了类器官和相应的患者肿瘤之间基因组、转录和表观基因组的一致性。利用这些类器官来了解表观遗传修饰物EZH2在驱动与神经内分泌前列腺癌进展相关的分子程序中的生物学作用。且通过高通量药物筛选，挑选出单一药剂和药物组合在类器官上试验药物，为制造有效药物提供依据
02 文章背景
前列腺癌是美国男性中最常见的癌症和男性癌症死亡的第二个主要原因，由雄激素驱动而产生。目前没有有效的治疗方法。
从CRPC-NE患者的转移活检中开发了患者来源的类器官。我们对这些新模型进行了分子表征，并说明了它们如何被用来操纵与神经内分泌表型建立相关的癌基因的表达和活性。为了筛选CRPC-NE新的药物靶点和组合做了高通量药物筛选
03 实验流程
过程：
1.类器官模型的构建
2.表达量探索
3.表观数据结果
4.变异情况探索
5.结论：模型能完美模拟其对应的CRPC-NE病人
04 实验结果
1. Development of patient-derived tumor organoid and xenograft models
病人来源的肿瘤器官和异种移植模型的研究进展
- 选取25例转移性前列腺癌患者的新鲜肿瘤组织用于类器官培养，最终只有4个病人的培育成功，成功率为16%(4/25)
观察是否有肿瘤相关的成纤维细胞分别分离和增殖，以进一步计划对肿瘤微环境进行研究。
将这些患者来源的类器官移植(PDOX)植入NOD scid gamma 小鼠中，然后作为PDOX-ORG(PDOX-ORG)体外培育
免疫组化显示，4种类器官及其PDOX均缺乏AR蛋白表达，并表达了经典的神经内分泌标志物
2. Molecular characterization of neuroendocrine models
神经内分泌模型的分子表征
为了确定类器官的基因稳定性，在2D和3D培养条件下以及在连续时间点(第10代和第35代)对有机物进行了WES，并将这些结果与患者匹配的转移瘤活检和PDOX进行了比较。CLONET评估的所有模型的肿瘤占比都很高(中位数98%)
- 将患者的类器官和相应的PDOX转录组图谱与已发表的26例局限性前列腺癌、33例转移性去势抵抗性腺癌(CRPC-ADEO)和13例CRPC-NE患者肿瘤进行了比较，发现CRPC-NE类器官与CRPC-NE患者肿瘤的分离一致
- 类器官和PDOX由于标志物的共同表达而聚在一起，包括MYCN、PEG10、SRRM4、EZH2、SOX2、BRN2和FOXA2的高表达
- AR标志基因低表达
在2D和3D培养中，基因表达没有显著差异
在有或没有双羟色胺的培养基中，都表达高水平的突触素，而缺乏AR的表达
使用ERRBS在全基因组范围内评估了类器官中富含CpG的甲基化。基于DNA甲基化，患者衍生的类器官模型与相应的患者肿瘤以及使用我们公布的数据集的其他CRPC-NE病例聚集在一起
基于涉及常见癌症相关基因以及同一疾病状态的患者肿瘤的mRNA和DNA甲基化群集的基因组改变的存在，这些模型似乎代表了他们匹配的患者和CRPC-NE。模型的高肿瘤纯度、肿瘤细胞间共同标记物的一致IHC分析以及良性标记物(即肝脏活检衍生器官中的良性肝脏标记物Hep Par 1)的缺乏表明细胞具有一定的异质性
3. Effects of EZH2 inhibition
抑制EZH2的作用
ZEST2的组蛋白甲基转移酶增强子(EZH2)是一种表观遗传修饰因子，在许多癌症类型中经常过表达，并支持癌细胞增殖和存活，EZH2是CRPC-NE进展的一个潜在的介导者。在CRPC-NE类器官和PDOX模型中，EZH2和H3K27me3的表达相当
用免疫荧光显示EZH2在细胞核中的表达，细胞周期调节因子E2F1正向控制EZH2转录。正如预期的那样，EZH2和E2F1在患者队列和器官中的表达高度相关
EZH2基因敲除导致其活性降低，通过H3K27甲基化测量其活性，并减少包括突触素(SYP)在内的经典神经内分泌标记物的表达，但AR仍为阴性。
通过GSEA发现EZH2抑制的靶基因在敲除后显著上调，干细胞和神经元程序下调，EZH2与不同癌症类型的干细胞特性和肿瘤启动细胞功能有关。
综上所述，EZH2与CRPC-NE失调有关，但在这种AR阴性的晚期CRPC-NE状态中，仅抑制EZH2并不足以重表达AR
为了了解抑制EZH2活性是否可以作为CRPC-NE的治疗选择，用EZH2抑制剂GSK343和GSK503处理CRPC-NE类器官。这导致H3K27me3的表达减少
4. High-throughput drug screening
高通量药物筛选
根据药物筛选，批准用于CRPC-Adeno患者的药物包括AR拮抗剂苯扎鲁胺，以及紫杉烷化疗药物Cabazaxel和docetaxel在CRPC-Adeno类器官中是有效的。CRPC-NE与CPRC-腺体类器官的药物筛选结果选出了一些药物，如HER和VEGFR2，在杀死CRPC-NE方面比对照 CRPC-Adeno 更有效
高通量药物筛选也突出了患者的特异性敏感性
靶向两条与CRPC-NE进展相关的通路可能是一种有效的方法
05 延伸
1. 类器官
类器官，从它字面本身含义很容易理解，类似于组织器官。其实它本身是一种基于3D体外细胞培养系统，建立的与体内的来源组织或器官高度相似的一种模型。这些3D体外培养系统可复制出已分化组织的复杂空间形态，并能够表现出细胞与细胞之间，细胞与其周围基质之间的相互作用和空间位置形态。而其本身又能做到与体内分化的组织器官具有相似的生理反应，与来源组织具有极高的相似性。与传统2D细胞培养模式相比，3D培养的类器官包含多种细胞类型，突破了细胞间单纯的物理接触联系，形成了更加紧密的细胞间，细胞与基质间高度相互作用，形成具有功能的“微器官”，能更好地用于模拟器官组织的发生过程及生理病理状态，因而在基础研究以及临床诊疗方面具有广阔的应用前景。
根据定义，类器官具备以下几个特征：
(1)必须包含一种以上与来源器官相同的细胞类型；
(2)应该表现出来源器官所特有的一些功能； (3)细胞的组织方式应当与来源器官相似
类器官的培养方法
类器官制备的典型方法首先要分离出胚胎或多能干细胞，然后将它们培养在一个支持介质(如基质胶Matrigel)上，使其能够三维生长。类器官中包含多种已分化的细胞类型，这些细胞类型在体内相应的器官中也有存在。比如，小肠上皮的所有细胞类型在Sato等报道的小肠类器官模型中均有体现。介导类器官形成的信号通路与体内器官发育与稳态维持的信号通路是相同的，培养的同时培养基中需要添加因子、生长因子和小分子等，以激活或者抑制参与类器官形成所依赖的特定信号通路。制备不同的类器官需使用不同的添加物组合，即使与小肠和结肠等结构非常相近的组织，制备类器官所需的添加物的组合也不尽相同。
总结一下目前类器官的培养制备方法，见下图：
目前3D类器官培养技术已经成功培养出大量具有部分关键生理结构和功能的类组织器官，比如：肾、肝、肺、肠、脑、前列腺、胰腺和视网膜等，在基础研究以及临床诊疗方面具有广阔的应用前景。
三、类器官的治疗潜能：
类器官培养体系的建立无论是对于基础研究或是临床治疗方面都有广阔的应用前景。
目前以及未来预测，类器官的研究将主要集中于疾病模型，如发育相关问题，遗传疾病，肿瘤癌症等。通过使用患者的iPSCs可建立有价值的疾病模型，并能在体外模拟重现病人疾病模型。同时，类器官的建立可以实现对药物药效和毒性进行更有效，更真实的检测，正是因为类器官可以直接由人类iPSCs直接培养生成，相比于动物模型很大程度上避免了因动物和人类细胞间的差异而导致的检测结果不一致。但目前在体外构建组织和器官仍是一大挑战，希望类器官的建立及研究可使这个挑战更进一步吧。虽然第一大步已经成功迈了出去，但仍有很多不完善的地方亟待解决，类器官的研究之路仍在继续努力ing。
四、类器官在癌症研究治疗中的应用
目前类器官多用于肿瘤癌症的研究中。
- 类器官的培养可用于临床前癌症的治疗检测及药物药效和毒性测试。
- 根据目前的研究进展，也建立了活体类器官“生物银行”
- 类器官的培养和建立可用于研究肿瘤生成过程中的突变过程：
从不同的健康器官培养克隆类有机物，然后对培养物进行全基因组测序，可以分析器官特异性突变谱。通过从同一肿瘤的不同区域培养无性繁殖的类细胞器，可以用来研究肿瘤内部的异质性。克隆培养的全基因组测序可以揭示区域特异性突变谱。利用与上述方法相似的方法，可以利用有机培养来研究特定化合物对健康细胞和肿瘤细胞突变谱的影响。
五、类器官局限性及展望：
- 相较于癌症细胞系的培养，类器官的体外培养需要消耗更多的时间和资源；
- 类器官相较于人体正常组织器官的生理环境，缺乏结缔组织，血管和免疫细胞的微环境；
- 类器官培养过程中一些体外因素如小鼠来源的细胞外基质(ECM)替代物、胎牛血清等可能影响一些实验结果，比如药物筛选实验等；
- 来自晚期癌症的类器官生长速度通常比来自正常上皮的类器官生长速度慢，这可能会导致肿瘤类器官过度生长通过混入正常上皮细胞来源的类器官。（由于更高的有丝分裂失败率和随后的肿瘤器官细胞死亡）
参考文献：Organoids-Preclinical Models of human Disease
2. 高通量药物筛选
高通量药物筛选是指以分子水平和细胞水平的实验方法为基础，以微板形式作为实验工具载体，以自动化操作系统执行试验过程，以灵敏快速的检测仪器采集实验结果数据，以计算机对实验数据进行分析处理，同一时间对数以千万样品检测，并以相应的数据库支持整体系运转的技术体系。
组成：
1.化合物样品库 化合物样品主要有人工合成和从天然产物中分离纯化两个来源。其中,人工合成又可常规化学合成和组合化学合成两种方法。 2.自动化的操作系统 自动化操作系统利用计算机通过操作软件控制整个实验过程。操作软件采用实物图像代表实验用具，简洁明了的图示代表机器的动作。自动化操作系统的工作能力取决于系统的组分，根据需要可配置加样、冲洗、温解、离心等设备以进行相应的工作。 3.高灵敏度的检测系统 检测系统一般采用液闪计数器、化学发光检测计数器、宽谱带分光光度仪、荧光光度仪等。 4.数据库管理系统 数据库管理系统承担4个方面的功能: 样品库的管理功能;生物活性信息的管理功能; 对高通量药物筛选的服务功能; 药物设计与药物发现功能。
模型：
常用的筛选模型都在分子水平和细胞水平，观察的是药物与分子靶点的相互作用，能够直接认识药物的基本作用机制。 1.分子水平的药物筛选模型:受体筛选模型;酶筛选模型;离子通道筛选模型 1.1受体筛选模型:指受体与放射性配体结合模型。以受体为作用靶的筛选方法,包括检测功能反应、第二信使生成和标记配体与受体相互作用等不同类型。 1.2酶筛选模型:观察药物对酶活性的影响。根据酶的特点,酶的反应底物,产物都可以作为检测指标,并由此确定反应速度。典型的酶筛选包括1) 适当缓冲液中孵化;(2)控制反应速度,如:温度,缓冲液的pH值和酶的浓度等;(3)单时间点数器, 需测量产物的增加和底物的减少。 1.3离子通道筛选模型: (1)贝类动物毒素的高通量筛选,其作用靶为Na 通道上的蛤蚌毒素结合位点，用放射性配体进行竞争性结合试验考察受试样品。(2)用酵母双杂交的方法高通量筛选干扰N型钙通道β3亚单位与α1β亚单位相互作用的小分子，寻找新型钙通道拮抗剂。 2.细胞水平药物筛选模型 观察被筛样品对细胞的作用,但不能反映药物作用的具体途径和靶标,仅反映药物对细胞生长等过程的综合作用。包括: 内皮细胞激活; 细胞凋亡; 抗肿瘤活性; 转录调控检测; 信号转导通路; 细菌蛋白分泌; 细菌生长。 高通量筛选技术与传统的药物筛选方法相比有以下几个优点:反应体积小；自动化；灵敏快速检测；高度特异性。但是，高通量筛选作为药物筛选的方法,并不是一种万能的手段，首先，高通量筛选所采用的主要是分子、细胞水平的体外实验模型，任何模型都不可能充分反映药物的全面药理作用；其次，用于高通量筛选的模型是有限的和不断发展的，要建立反映机体全部生理机能的理想模型，也是不现实的。但我们应该相信，随着对高通量筛选研究的深入，随着对筛选模型的评价标准、新的药物作用靶点的发现以及筛选模型的新颖性和实用性的统一，高通量筛选技术必将在未来的药物研究中发挥越来越重要的作用。
检测方法：
光学测定技术。美、英两国研究人员在高通量筛选检测中，努力进行了光学测定方法的研究，建立了大量的非同位素标记测定法，如用分光光度检测法筛选蛋白酪氨酸激酶抑制剂、组织纤溶酶原激活剂等，均获得成功。 放射性检测技术。美国学者GanieSM在高通量药物筛选研究中，应用放射性测定法，特别是亲和闪烁（SPA）检测方法，使在96孔板上进行的样本量实验得到发展。该方法灵敏度高，特异性强，促进了高通量药物筛选的实现，但存在环境污染问题。 荧光检测技术。美国学者GiulianokA研究认为，采用FLIPR（fluor ometricimaging readet）荧光检测法，可在短时间内同时测定荧光的强度和变化，对测定细胞内钙离子流及测定细胞内pH和细胞内钠离子流等，是非常理想的一种高效检测方法。 多功能微板检测系统。由西安交通大学药学院研制的1536孔板高通量多功能微板检测系统，是国际上先进的高通量检测系统，它可使筛选量进一步提高，现已在该院投入使用。
