下面是100个lncRNA组装案例文献分享
标题：Epigenetic landscape analysis of lncRNAs in acute myeloid leukemia with DNMT3A mutations
标题：DNMT3A突变急性髓系白血病的lncRNAs表观遗传图谱分析
杂志：Annals of T ranslational Medicine（2020）
通讯作者：戴钰俊
机构：中山大学肿瘤中心血液肿瘤科
文章链接：http://dx.doi.org/10.21037/apm.2020.02.143
摘要：
背景：急性髓系白血病(AML)是由一组高度异质性的血液系统恶性肿瘤组成的一种癌症。DNA甲基转移酶3A(DNMT3A)突变的AML患者预后较差。据报道，一些长的非编码RNA(LncRNAs)可以提高治疗敏感性，从而影响细胞遗传正常的晚期急性髓系白血病(CN-AML)患者的总体生存率，但关于DNMT3A突变的AML中的lncRNA特征的研究很少。
方法：建立DNMT3A R878H条件性敲入小鼠模型，采用Cuff比较法检测DNMT3A突变的lncRNAs。用顺式和反式调节网络预测候选基因。用博德研究所肿瘤细胞系百科全书(CCLE)和OncoLnc数据库分析白血病细胞系的表达水平和这些候选基因的预后指数。使用GraphPad Prism对每个样本的数据进行统计分析。
结果：本研究应用DNMT3A R878H条件性敲入小鼠模型，采用卡夫比较法研究了DNMT3A突变的lncRNA表观遗传格局。在 Dnmt3a^R878H/WT^Mx1-Cre^ ^ 小鼠中发现了53个差异表达的LncRNAs。接下来，我们通过顺式和反式调控网络预测了这些lncRNAs调控的下游靶基因，发现124个候选基因与这些lncRNAs相关。在对124个基因的进一步分析中，我们发现 interleukin 1 receptor type 2 (IL1R2）、Krüppel-like factor 13 (KLF13),、A TPase H 转运V1亚单位A(ATP6V1A)、蛋白酶体26S亚单位、非A TPase 3(PSMD3)和吡咯啉-5-羧酸还原酶2(PYCR2)的mRNA表达水平升高与AML预后不良相关。功能分析表明，在Dnmt3a^R878H^/WTMx1-CRE^ ^小鼠中，参与自噬、细胞周期和造血干细胞分化的通路更加丰富。
结论：本研究首次利用DNMT3A R878H条件性敲入小鼠模型预测AML中受DNMT3A突变调控的特异性lncRNA。有6个候选基因与DNMT3A突变相关，预后差。我们的研究结果为这种疾病提供了一种可能的治疗策略。
关键词：lncRNA；DNMT3A R878H；敲入小鼠；RNA-seq
材料方法
Dnmt3a^R878H/WT^Mx1-Cre^ ^ 和 Dnmt3a^WT/WT^Mx1-Cre^ ^ 小鼠的脊髓
DNMT3A由3个主要结构域组成：PWWP结构域、ADD结构域和C-末端催化域，绝大多数突变主要发生在C-末端催化域。
为了进一步探讨驱动错义突变DNMT3A-R882H的作用机制，我们利用先前报道的小鼠模型，通过Cre介导的内源性剪接表达了突变的DNMT3A R878H。
将在造血系统中特异表达的干扰素诱导Mx1启动子(Mx1Cre)的小鼠与DNMT3A突变小鼠杂交，然后用pIpC取代内源性DNMT3A外显子23，诱导DNMT3A R878H的表达。
突变情况
2.RNA测序
测序平台：Illumina MiSeq 200-bp paired-end
3.lncRNA预测
- 比对：TopHat
- 组装：cufflinks
- 筛选：
- 长度≥200bp，外显子数量≥2
- ORF＜300bp
- Pfam，CPC ,CNCI去除具有蛋白编码能力的转录本
- 转录本类型：i u x
4.lncRNA靶基因预测
选择距离小于10kb的不含lncRNA的基因作为顺式调控的靶基因。
5.生存分析
主要是依赖于公共数据库
结果
1.DNMT3A基因在急性髓系白血病中的遗传图谱
为了探索DNMT3A在急性髓系白血病中的遗传图谱，我们利用cBioPortal对急性髓系白血病患者的DNMT3A改变进行了分析。531名患者中有114个样本DNMT3A改变， 并且主要是错义突变（p.R882驱动）和截断突变（putative driver），还包含一个意义未知的的整码突变和15个意义未知的错义突变。
p.R882 高频点突变，是预后不良的分子标志。
图B.四种不同突变类型换这个DNMT3A图变数。
图C.分析DNMT3A突变的详细癌症类型;NPM1最多。
2.RNA-sequence of Dnmt3a R878H mice
可以看到是6只小鼠的转录组测序数据，它们可以分成两个泾渭分明的不同组：
结果表明，小鼠样本间的相似性较高，相关系数均在0.9以上，说明样本选择的实验可靠性和合理性。
3.小鼠新lncRNA的预测结果
使用cuffdiff鉴定到23个差异表达的lncRNA。这个差异分析比较容易复现，基本上看我六年前的表达芯片的公共数据库挖掘系列推文即可；
- 解读GEO数据存放规律及下载，一文就够
- 解读SRA数据库规律一文就够
- 从GEO数据库下载得到表达矩阵 一文就够
- GSEA分析一文就够（单机版 R语言版）
- 根据分组信息做差异分析- 这个一文不够的
- 差异分析得到的结果注释一文就够
接着去预测差异表达的lncRNA的靶基因。大量lncRNA的功能是未知的，但是它们主要是cis-regulators，所以可以根据它们临近的蛋白编码基因功能来近似推断，然后表达量的相关性也可以类推到。
- 根据位置关系推断 使用bedtools等工具！
- 表达量的相关性， 比如杂志Cancer Medicine, 2020的文章《 Genome-wide DNA methylation analysis by MethylRad and the transcriptome profiles reveal the potential cancer-related lncRNAs in colon cancer》，在进行结直肠癌相关lncRNA的功能富集分析，就是采用LncRN2Target v2.0和StarBase分析与15个lncRNA共表达的蛋白编码基因，其中lncRNA HULC和ZNF667-AS1分别鉴定到28个、9个共表达的蛋白编码基因！
研究者通过分析 找到11个顺式调控候选基因。113个反式调控候选基因。
在Dnmt3a^R878H/WT^Mx1-Cre^ ^ 和 Dnmt3a^WT/WT^Mx1-Cre^ ^间分析了这些候选基因的表达水平差异。这里使用EdgeR进行分析。
对差异基因的预后分析，发现了13个与急性髓系白血病预后密切相关的基因。
4.急性髓系白血病候选基因的功能分析及预后
IL1R2(P=0.0022)、KLF13(P=0.0134)、ATP6V1A(P=0.0295)、PSMD3(P=0.0165)和PYCR2mRNA水平升高与急性髓系白血病患者的总生存期(OS)显著相关(图6A)。
接下来，作者选择了两个细胞株OCI-AML3(含有DNMT3A R882C突变和NPM1突变)和OCI-AML2(含有DNMT3A R635W突变)，试图探讨这些基因在具有NPM1和/或DNMT3A突变的AML患者细胞系中的表达水平。基于CCLE的结果显示，与OCI-AML2细胞相比，这些异常基因在OCI-AML3细胞中表现出更高的表达。
通过差异lncRNA预测调控的靶基因，然后分析差异表达的靶基因，进而发现与预后相关基因。
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