今天跟大家分享的是2020年2月发表在SCIENTIFIC REPORTS（IF：3.998）杂志上的一篇文章，在文章中作者利用GEO数据集，鉴定腰背痛的DEGs，然后通过功能注释、富集分析以及PPI网络构建，筛选到重要基因生物标志物，并通过各种生物信息学程序对其进行识别和分析。
标题：Identification of significant gene biomarkers of low back pain caused by changes in the osmotic pressure of nucleus pulposus cells
识别由髓核细胞渗透压力变化引起的腰背痛的重要基因生物标志物
一、研究背景
髓核（NP）细胞渗透压变化引起的椎间盘（IVD）变性疾病的发病率随年龄增长而增加。通常，腰背痛与IVD变性有关。然而，尚未阐明腰背痛的机制和分子靶标，也没有数据表明下腰痛的特定生物标志物。因此，该研究旨在鉴定和验证腰痛的重要基因生物标志物。在Gene Expression Omnibus（GEO）数据库中筛选了差异表达的基因（DEGs），并且还使用各种生物信息学程序对重要的基因生物标记物进行了鉴定和分析。
二、流程分析
三、结果解读
1、DEGs的鉴定
鉴定在高渗培养基中培养的NP细胞与在等渗培养基中培养的NP细胞之间的DEG。作者使用limma软件包从数据集（GSE1648）中鉴定出371个DEG，其中包括128个下调的DEG和243个上调的DEG。使用火山图显示了在高渗培养基中培养的IVD细胞与在等渗培养基中培养的IVD细胞之间的DEG。下调的DEG用绿色标记，而上调的DEG用红色标记（图1）。
图1. DEGs的火山图
2、功能注释和富集分析
分别使用DAVID、Metascape、GSEA进行分析。
（1）通过DAVID分析，基因本体分析的结果表明：
- 与生物学过程（BP）相关的DEG变化主要集中在疼痛和炎症反应的感官感知上（图2A）。
- 与细胞成分（CC）相关的DEG变化在突触后膜、突触、神经肌肉接头、乙酰胆碱门控通道复合物、电压门控钙通道复合物和L型电压门控钙通道复合体中显著丰富（图2B）。
- 关于分子功能（MF），DEG在趋化因子活性、单加氧酶活性和电压门控钙通道活性中显著丰富。（图2C）
- 对KEGG通路（KEGG）的分析表明，与DEG相关的最常见的经典通路是谷氨酸能突触和神经活性配体-受体相互作用。（图2D）
（2）使用Metascape进行的功能富集分析表明：
- DEGs显著富集了突触信号、突触组织、神经活性配体-受体相互作用和谷氨酸能突触（P< 0.05）（图2E~G）。
图2. DGEs的DAVID、Metascape分析
（3）使用GSEA进行基因本体（包括BP、CC、MF）分析表明：
- 高渗NP细胞中1274/4081基因被上调。（表1、图3）
表1. 根据归一化的富集得分按顺序列出了上调和下调基因组中最显著的富集
图3：上调和下调的基因集中的六个最重要的图
（4）GSEA进行的KEGG富集分析表明：
- 与等渗NP细胞相比，高渗NP细胞中70/168个基因组被上调，而98/168个基因组被下调。（表2、图4）
表2. 根据归一化富集得分按顺序列出了上调和下调基因组中最显著的富集
图4. 上调和下调的基因集中的六个最重要的图
3、PPI network（蛋白质-蛋白质相互作用网络）构建和模块分析
- 作者通过Metascape分析，构建了DEG的蛋白质-蛋白质相互作用网络并从中识别出三个MCODE模块（图5A~D）。
图5. PPI网络和3个MCODE模块
- 作者通过STRING执行PPI网络的构建。 PPI网络中有539个边和225个节点（PPI富集p<0.05）（图6A）。
- 作者通过Cytoscape从PPI网络中识别出六个MCODE模块（图6B–G）。 鉴定出10个中枢基因：OPRL1，CCL5，IL10，IGF1，CCL4，SST，GRM1，PVALB，CXCL13和NTS（图6H）。
图6. PPI网络和6个MCODE模块
4、重要基因的识别和分析
（1）识别
VENN 图显示， "Metascape_MCODE"， "Cytoscape_MCODE" 和 "Cytoscape_cytoHubba" 有四个重要的常见基因，包括 CCL5、OPRL1、SST 和 CXCL13（图 7A）。
（2）分析
- 分层聚类表明，重要基因可以在很大程度上区分在高渗介质中培养的NP细胞与等渗介质培养的NP细胞。与等渗介质培养的NP细胞相比，高渗介质培养的NP细胞中CXCL13的表达升高，OPRL1、CCL5和SST的表达降低（图7B）。
- Pearson 相关分析表明，CCL5 和 OPRL1 之间有正相关关系（图 7C）。
- 通过毒理基因组学比较数据库对与疼痛和椎间盘变性相关的重要基因进行了鉴定，如图7D~G所示。
图7. 重要基因的鉴定和分析
- 定量实时PCR分析显示，在等渗介质中培养的NP细胞中CCL5（图8A）、OPRL1（图8B）和SST（图8C）的相对表达水平明显高于在超渗透介质中培养的。而CXCL13 的相对表达水平则恰好相反（图 8D）。
图8. 定量实时PCR分析
- NRS、渗透压力、CCL5 和 OPRL1 之间的强关联 通过Pearson相关性分析得到了NRS、渗透压力、CCL5 和 OPRL1四者两两之间的相关关系（图8E~图8J ）。 通过热图显示 NRS、渗透压力、CCL5、OPRL1、SST 和 CXCL13 之间的强关联。其中CCL5 和 OPRL1呈正相关关系（图 8K）。
图8. NRS、渗透压力、CCL5 和 OPRL1 之间的强关联
- NRS与相关基因表达的关联 作者通过单变量和多变量线性回归得出：NRS与CCL5、OPRL1、SST和CXCL13 显著相关（表5）。
表5. NRS和相关基因表达之间的线性回归分析
- NRS相关基因表达比例危害分析的单变量逻辑回归 OPRL1和CCL5 高表达对NRS有重大有害影响。而SST 和 CXCL13 对 NRS无重大的有害影响（表6）。
表6. 基于单变量logistic比例回归分析的相关参数对NRS的影响
- 基于多变量逻辑回归的 NRS 的独立风险因素 对于OPRL1和CCL5进行多变量逻辑回归分析，结果表明CCL5在个体中表达的较高与风险显著增加有关（表7）。
表7. 基于多重逻辑比例回归分析的相关基因对NRS的影响
5、预测模型
- CCL5 和 OPRL1 的表达水平可以通过ROC曲线灵敏地、具体地预测 NRS ROC曲线表明，CCL5、OPRL1的表达水平分别可以敏感而具体地预测NRS（NRS曲线下的面积， 0.985 ; p<0.001）（图8L、图8M）。
图8L. CCL5的ROC曲线 图8M. OPR1的ROC曲线
- 神经网络预测模型和NRS高风险预警范围 训练后，神经网络预测模型达到最佳效果，其中2000Epoch时均方误差为0.0076566（图9A），相对性为0.98987（图9B）。通过根据实际值验证数据的预测值，作者发现只有很小的差异（图9C，D.）通过立方样条插值算法，作者发现了NRS的高风险警告指标：CCL5 <7 或>8.5 和 3.5 <OPRL1<8（图9E）。此外，三维立体图可以准确地显示警告范围（图9F)
图9. 神经网络预测模型和NRS的高风险警告范围
小结
本篇文章的研究思路和过程较为简单，通过GEO数据库分析鉴定了371个DEG作为候选基因生物标志物，并进行了功能注释和富集分析，进一步选定了4个基因作为研究对象，分别是CCL5、OPRL1、SST 和 CXCL13。通过统计分析发现CCL5、OPRL1、SST和CXCL13这四个基因均与腰背痛相关。其中，CCL5和OPRL1的表达与腰背疼痛最相关。最后用ROC曲线、神经网络预测模型和高风险预警范围分析了CCL5、OPRL1的诊断作用。这些结果表明CCL5、OPRL1、SST和CXCL13这四个基因被确定为腰背痛的重要基因生物标志物。特别是，CCL5和OPRL1。本研究可为今后深入研究确定腰背痛的基因生物标志物提供参考。
