大家好，今天和大家分享的是2020年1月在发表在Clinical Epigenetics(IF=5.028)上的一篇文章：“ Prognostic and predictive value of PD-L2 DNA methylation and mRNA expression in melanoma”。作者构建了包含PD-L2靶向基因的珠芯片Beadchip，由此发现了PD-L2基因甲基化会引起mRNA表达量变化，最终导致黑色素瘤患者的存活率发生变化。此外，作者还探讨了mRNA表达量变化影响患者存活率的具体路径。
Prognostic and predictive value of PD-L2 DNA methylation and mRNA expression in melanoma
PD-L2甲基化和mRNA表达量对于黑色素瘤的预后和预测价值
一、背景介绍
黑色素瘤是黑色素细胞来源的一种高度恶性的肿瘤，其中皮肤恶性黑色素瘤占皮肤恶性肿瘤发病的第三位，给病人带来很大的痛苦。目前主流的治疗方法是使用程序性细胞死亡（PD-1）途径的免疫检查点抑制剂，从而诱导黑色素瘤的消退，然而这种治疗方法会给患者带来长期的免疫副作用。PD-L1和PD-L2是跨膜受体PD-1的配体，可以和PD-1相互作用，从而对免疫细胞产生负调控作用。相关研究发现，虽然PD-L2在人体中的表达量低于PD-L1，但它与PD-1的亲和力很高，所以可能具有对黑色素瘤的预后和预测价值。作者通过构建PD-L2特定靶点的珠芯片，并利用TCGA数据库中的相关数据来进行相关性分析和p-value分析，发现了PD-L2甲基化→mRNA表达量变化→黑色素瘤病人存活率变化的具体途径和机制。
二、分析流程
三、结果解读
1.PD-L2甲基化影响了mRNA的表达
作者首先展示了构建的Beadchip，里面包含5个PD-L2的CpG位点：位于启动子区的cg07211259、位于启动子侧翼的cg14440664和cg14351952，以及位于基因体的cg14133064和cg14374994。
图1.BeadChip中的五个甲基化CpG基因
接着，作者利用该BeadChip，从TCGA数据集中研究了468例黑色素瘤患者体内CpG位点甲基化与mRNA表达量之间的关系（表1）。从Spearman相关性分析和p值检验可以看出，在5个甲基化的CpG位点中，PD-L2甲基化与mRNA表达量之间有显著的负相关性。其中，位于启动子区的cg07211259和位于启动子侧翼的cg14440664与mRNA表达量的负相关性最强；而位于启动子区和基因体的其他CpG基因则与mRNA表达量呈正相关。
表1.从前两列数据可以看出，PD-L2的甲基化与mRNA的表达呈明显的负相关
2.PD-L2甲基化通过影响mRNA的表达量，从而影响黑色素瘤患者的生存率。
作者根据mRNA表达量和指定的CpG位点来进行分组，对黑色素瘤患者的整体生存率进行Kaplan-Meier分析（图2）。结合结果可以发现，mRNA表达量高的组所对应的患者生存率更高（图2a）；由于cg14440664是与mRNA表达量正相关的（表1），所以cg14440664表达量高的组所对应的患者生存率更高（图2b）；由于cg07211259是与mRNA表达量负相关的（表1），所以cg07211259表达量高的组所对应的患者生存率更低（图2c）。这说明了PD-L2甲基化通过影响mRNA表达量变化，进而影响黑色素瘤患者生存率变化。
图2；三幅图分别对应着(a)、(b)、(c)
3.PD-L2甲基化通过影响mRNA的表达量，从而影响肿瘤浸润免疫细胞评分
作者利用mRNA表达量和各个CpG位点，来对很多种类的免疫细胞进行Spearman等级相关性分析（图3）。从结果可以看出，mRNA表达量与肿瘤浸润免疫细胞评分之间有很强的正相关性；cg07211259和cg14133064与肿瘤浸润免疫细胞评分之间有显著的负相关性（这是由于它们与mRNA表达量呈负相关）；cg14440664、cg14351952、14374994与肿瘤浸润免疫细胞评分之间有显著的正相关性（这是由于它们与mRNA表达量呈正相关）。这说明了PD-L2甲基化通过影响mRNA表达量，进而影响肿瘤浸润免疫细胞。
图3. 不同行表示mRNA表达量和CpG位点；不同列表示不同种类的免疫细胞
4.PD-L2甲基化通过影响mRNA的表达，从而影响IF-γ的表达
已知IF-γ是黑色素瘤的预后和预测因素。 作者对mRNA表达量和IF-γ进行了相关性分析，又对CpG位点IF-γ进行了相关性分析（图4）。从结果可以看出，mRNA表达量与IF-γ之间有显著的正相关性（p<0.001）；cg07211259、cg14133064与IF-γ之间有显著的负相关性（这是因为它们与mRNA表达量呈负相关）；cg14440664、cg14351952、cg14374994与IF-γ之间有显著的正相关性（这是因为它们与mRNA表达量呈正相关）。这说明PD-L2甲基化通过影响mRNA表达量，进而影响IF-γ表达。
图4
5.PD-L2甲基化通过影响IF-γ的表达，从而影响了PD-L2蛋白质的表达
作者用IF-γ对细胞系进行了72h处理，结果发现：PD-L2甲基化显著影响了PD-L2蛋白表达(p=0.014)（图5a）； 作为对照，作者分别对不同的细胞系进行了IF-γ处理/对照处理，结果发现：PD-L2甲基化与PD-L2蛋白质表达没有相关性(p=0.34)（图5b）。 可以看出，PD-L2甲基化通过IF-γ，进而影响PD-L2蛋白质表达量。
图5
6.PD-L2甲基化和mRNA表达量显著影响了黑色素瘤患者的生存率
作者对不同CpG位点和mRNA表达量分组，研究了每一组对应的患者生存率（图6）。 结果发现：cg07211259的高甲基化对应着患者的低生存率(p=0.02)（这是因为cg07211259与mRNA表达量负相关）（图6a）；mRNA的高表达量对应着患者的高生存率(p=0.03)（图6b）。 这说明了PD-L2甲基化通过影响mRNA表达量，进而影响了黑色素瘤患者的生存率。
图6
小结
在本篇文章中，作者首先发现了PD-L2甲基化可以影响黑色素瘤患者的生存率，并依此展开研究。作者构建了包含PD-L2 CpG位点的BeadChip来进行分析，发现了PD-L2甲基化与mRNA表达量之间的相关性，然后研究了“PD-L2甲基化→mRNA表达量变化→患者生存率变化”的具体通路，找到了肿瘤浸润免疫细胞和IF-γ这两种表型，最终阐明了PD-L2甲基化是如何一步步影响黑色素瘤患者生存率的。其中，最值得学习的是作者的论证逻辑，作者只对每组数据进行了相关性分析等简单操作，但通过对数据的挖掘和逻辑推导，得到了令人满意的结果。
编辑：豆沙粽
校审：糯米饭，碎碎冰，鳕鱼堡
