题目：计算机识别具有潜在膀胱癌预后和免疫治疗意义的肿瘤浸润B淋巴细胞lncRNA signature
一.背景知识
长链非编码RNA（lncRNA）是一类在细胞发育过程中起重要调控作用的非编码RNA。越来越多的证据表明lncRNA与免疫系统的发育和功能相关。不同免疫细胞亚群中lncRNA的出现频率也不同，具有细胞类型的特异性，且lncRNA的表达模式与TME中免疫细胞的浸润有关。然而，B细胞特异性lncRNA在预测患者预后和免疫治疗应答方面的潜在用途仍尚未得到阐明。膀胱癌（BCa）是最常见的癌症类型之一，根治性膀胱切除术以及放疗、化学疗法和免疫疗法已成为其治疗的主要手段，因此，BCa的风险分层和治疗反应预测需要更准确的分子生物标志物。
二.分析流程
三、结果解读
1.鉴别B细胞特异性的预后lncRNA
首先在B细胞系和其他免疫细胞系中进行lncRNA差异表达分析，基于FDR识别出141个lncRNA在B细胞系中高表达，而在其他免疫细胞系中低表达，为B细胞特异性lncRNA。然后在包括202个BCa患者的TCGA discovery dataset中，用单变量Cox回归分析这141个lncRNA的表达与生存时间的关系，鉴别出24个与生存时间显著相关的B细胞特异性lncRNA（P<0.05）。
2.在TCGA RNA-seq数据集鉴别和评估TILBlncSig预测预后的能力
为了从上述24个lncRNA中找到最适合预测的标志，在discovery dataset的202个BCa患者中对lncRNA表达和临床信息进行逐步回归（MASS包stepAIC函数）以及多变量回归，最终得到由8个B细胞特异lncRNA组成的signature并命名为TILBlncSig（图1）。为了应用到临床，把多变量Cox回归中TILBlncSig的coefficient加权转化为风险指数：TILBlncSig score= (−0.2438∗expression value of TNRC6C-AS1) (−0.3929∗expression value of WASIR2) (0.2234∗expression value of PART1) (−0.4645∗expression value of GUSBP11) (0.6849∗expression value of MAFG-DT) (0.4178∗expression value of LINC01184) (−0.3453∗expression value of OGFRP1) (−0.3408∗expression value of AC090515.2)。同时，多变量Cox分析也表明这8个lncRNA的预测能力是相互独立的。
图1.8个TILBlncSig
按上述风险指数计算discovery dataset中每个患者的TILBlncSig score，并用其中值(median value=0.1176)作为risk cutoff，将202个患者分为高表达组(n=101)和低表达组(n=101)，生存分析表明低表达组OS延长，低表达组3年和5年生存率(89.7%和78.9%)显著高于高表达组(37.2%和31%)。然后在TCGA internal testing dataset中验证了TILBlncSig的预测能力。用相同的风险指数模型和risk cutoff 将201个患者分为高表达组和低表达组，生存分析表明低表达组的3年和5年OS（78.6%和75.8%）显著高于高表达组（50.6%），且ROC曲线显示出较好的区分度（图2）。多变量Cox比例风险回归分析的HR也表明TILBlncSig与OS显著相关（图3）。
图2.TCGA数据集中TILBlncSig的3年/5年OS ROC曲线
图3.TILBlncSig和临床病理因子的多变量Cox分析可视化
3.TILBlncSig与TIL-Bs关联
为了探索TILBlncSig的功能意义，计算了mRNA和8个TILBlncSig lncRNA表达之间的相关性，并筛选出前1%相关的mRNA为共表达的mRNA。这些共表达mRNA的GO和KEGG富集分析表明，TILBlncSig与免疫应答和肿瘤标志(cancer hallmark)相关的生物学通路高度相关（图4AB）。接下来，又结合免疫细胞特异性标志基因，进一步用single-sample GSEA评估了高表达组和低表达组患者的19个免疫亚群免疫浸润水平。如图4C，11个免疫亚群显著富集于高表达患者组，只有两个亚群(CD8 T-cell-activated和gamma-delta T-cells)富集于低表达组。其中，高表达患者中的单核免疫细胞（包括B细胞）尤其高表达于其他免疫细胞亚群。BCa细胞系数据中进一步的比较分析表明，与其他BCa细胞系相比，TILBlncSig中有4个lncRNA显著高表达于B细胞（图4D），表现出B细胞的表达特异性。上述结果共同表明，TILBlncSig不仅与预后相关，还具有TIL-B表达特异性。
图4.TILBlncSig的功能特征
4.TILBlncSig在微阵列平台多个独立验证集的预后能力
为了评估TILBlncSig的预测稳健性，进一步在微阵列平台的多个独立数据集中验证。在GSE31684(Affymetrix HG-U133_Plus 2.0 platform)的93个患者中，TILBlncSig仍可以区分患者生存的高低风险，高风险组预后低于低风险组(p=0.065,log-rank test)。单变量分析中，TILBlncSig也显示出与OS的紧密联系（图5）。
图5.GSE31684验证集验证TILBlncSig的预测效能
第二个独立数据集GSE5287( Affymetrix HG-U133A platform)中，只有1个TILBlncSig lncRNA(PART1)，因此将30个患者分为PART1高表达组(n=15)和低表达组(n=15)，如图6所示，基于PART1预测的KM生存曲线虽然没有显著的统计学差异，但是高PART1患者风险高于低表达组。这个趋势与发现集中的观察一致，表明lncRNA PART1是一个风险因子。（图6）
图6.GSE5287验证集验证TILBlncSig的预测效能
第三个数据集GSE38264(HuGene-1_0-st platform)包含了28个患者及4个TILBlncSig lncRNA(TNRC6C-AS1、PART1、GUSBP11和OGFRP1)。用同样的风险模型将患者分为高低表达组，比较了lncRNA的表达水平，发现其中3个lncRNA(TNRC6C-AS1、GUSBP11和OGFRP1)显著高表达于低表达组，而PART1相对低表达于高表达组，说明TNRC6C-AS1、GUSBP11和OGFRP1是保护性因子，而PART1是风险因子，与上述发现一致。
5.TILBlncSig与常规临床特征的独立性
为了进一步验证TILBlncSig是否为独立的预后因素，在三个BCa患者队列中进行多变量Cox回归分析（图7），协变量包括TILBlncSig和其他的常规临床因素。discovery和internal testing dataset的结果表明，TILBlncSig和疾病阶段(stage)是OS的独立预后因素。且GSE31684验证集的多变量分析中，TILBlncSig与OS仍保持显著相关性。因此可以得出结论，TILBlncSig是独立于其他常规临床因素的OS预测因子。
图7.TILBlncSig独立于其他临床特征
6.独立lncRNA和结合其他转录本的lncRNA预测能力比较
以往描述了由lncRNA，microRNA和蛋白质编码基因（PCG）组成的转录组特征预测BCa预后的能力。因此，又利用TCGA数据集中PCG、miRNA和lncRNA的表达数据，比较了PCG-lncRNA-microRNA后TILBlncSig的预测能力。
ROC曲线（图8A）显示，相同的TCGA数据中，TILBlncSig OS的3年和5年AUC（0.792和0.771）高于PCG-lncRNA-microRNA signature的3年和5年OS的相应AUC（0.588和0.594）。进一步比较Kaplan–Meier生存曲线（图8B），TILBlncSig预测的高风险评分患者预后比PCG-lncRNA-microRNA信号预测的高风险评分的患者预后更差，而TLBlncSig预测的低风险评分的患者预后较好。这些结果证明，TILBlncSig比PCG-lncRNA-microRNA标志具有更好的预后能力。
图8.PCG-lncRNA-microRNA signature和TILBlncSig的预测能力比较
7.TILBlncSig是预测免疫治疗应答的潜在因子
最后探索了TILBlncSig预测免疫治疗应答的能力。首先计算了TILBlncSig与免疫检查点基因（PD1和PD-L1）表达水平之间的关联。如图9A所示，TILBlncSig与免疫检查点基因表达呈显著正相关。进一步比较TILBlncSig分层的高危和低危人群中免疫检查点基因的表达模式发现，高危患者的免疫检查点基因表达水平明显高于低危患者组（ Wilcoxon秩和检验）（图9B），这与先前的报道一致，即免疫检查点基因参与免疫抑制，其高表达与不良预后有关。为了进一步探索TILBlncSig和免疫检查点基因之间的cross-talk对患者生存的影响，基于TILBlncSig和免疫检查点基因的表达组合将患者分为四组，并比较生存率。比较结果显示，TILBlncSig能够显著区分具有相同或相似水平的免疫检查点基因的患者的生存（P = 0.001，对数秩检验）（图9C）。与其他三组相比，TILBlncSig低表达和免疫检查点基因高表达的患者预后较好，而TILBlncSig表达高和免疫检查点基因表达低的患者预测最差。此外，对于TILBlncSig低表达的患者，免疫检查点基因的表达水平与预后没有显著关联（PD-1 P=0.5，PD-L1 P=0.1，对数秩检验） 。而对于TILBlncSig高表达的患者，免疫检查点基因的表达水平与预后有显著关联（PD-1 P=0.04，PD-L1 P=0.09，对数秩检验），免疫检查点基因高表达患者预后更好。
图9.TILBlncSig于免疫检查点基因表达对患者生存的影响
观察到TILBlncSig与免疫检查点基因之间的关联后，假设TILBlncSig可以预测免疫治疗反应，在包含临床和转录组数据的ccRCC免疫疗法数据集中测试了TILBlncSig的预测价能力。同样，用TILBlncSig score的risk cutoff分组后，KM曲线表明抗PD-1单药治疗的高风险组和低风险组之间的生存率存在显著差异（图10A）。此外，免疫治疗应答的ROC曲线表明，TILBlncSig（AUC=0.609）与免疫检查点基因标记（PD-1 AUC=0.646，PD-L1 AUC=0.625）的预测能力相当。而结合PD-1表达后，TILBlncSig的区分能力提高（AUC从0.646增加到0.719）（图7B）。
图10.TILBlncSig预测免疫治疗应答的能力
小结
通过综合分析免疫、lncRNA和临床特征，从141个B细胞特异性lncRNA中鉴定出包含8个lncRNA（TNRC6C-AS1，WASIR2，GUSBP11，OGFRP1，AC090515.2，PART1，MAFG-DT和LINC01184）的TILBlncSig。 多个独立数据集验证表明，TILBlncSig能够独立于其他临床协变量而区分更差的预后。而功能分析表明，TILBlncSig在单核免疫细胞（自然杀伤细胞，B细胞和肥大细胞）中有浸润特异性，并且与癌症和免疫抑制表型有关。 此外，还分析了TILBlncSig与免疫治疗应答的关系，发现TILBlncSig能够预测抗PD-1治疗患者的生存预后和免疫治疗应答，且结合免疫检查点基因标记物后预测能力提高。 总的来说，这篇学习笔记从非编码RNA的角度强调了TILBlncSig作为TME中免疫细胞浸润的指标的价值，并加强了lncRNA作为免疫治疗反应的预测生物标志物的潜在应用，值得进一步探索。点击“阅读原文”可获取学习笔记原文。我们下期再见！
