00 文章简介
英文标题：A Targetable EGFR-Dependent Tumor-Initiating Program in Breast Cancer
中文标题：乳腺癌EGFR靶向依赖的肿瘤启动程序
期刊：《Cell Reports》
影响因子：8.032 发表时间：2017.10
研究领域：乳腺癌
DOI号：10.1016/j.celrep.2017.10.015
01 文献概括
三阴性乳腺癌在多个水平上存在异质性，且目前尚未有针对化疗耐药患者的靶向治疗药物，并且针对EGFR的疗法虽然能提高临床受益率但在乳腺癌亚群中具有不可预测性。作者通过构建PDXs模型，筛选到一个特殊应答的PDX(GCRC1735)，该例样本对药物治疗效果非常敏感。对GCRC1735的3500个细胞进行单细胞转录组测序分析，鉴定出6个细胞亚群，其中EGFR高表达的细胞在间充质/细胞样细胞亚群中显著富集。分选EGFRhi和EGFRlo细胞亚群，且EGFRhi亚群表现出增强的干细胞样特征，包括ALDH活性、球状形成效率、致瘤性和转移性。表明EGFR依赖性的细胞扩增和分级状态转变。在独立的PDX中鉴定了类似的致瘤性EGFR亚群，其中EGFR表达与吉非替尼敏感性相关，为TNBC患者中EGFR依赖性分级以及治疗干预提供了新的理解。
02 研究背景
三阴性乳腺癌(TNBC)：ER、PR、HER2均为阴性的乳腺癌，其在多个水平上存在异质性；大约30%的TNBC对标准化学治疗药物敏感，可提高生存率，但目前尚未有获批的针对化疗耐药患者的靶向治疗药物；
表皮生长因子受体(EGFR)在部分TNBC高表达，但EGFR靶向疗法的临床受益率只有1.7%-38.7%，表明针对EGFR的疗法在乳腺癌亚群中具有可变且不可预测的反应；
肿瘤起始细胞(TICs)是一种类似干细胞的亚群，负责维持肿瘤的长期克隆，在治疗耐药中被广泛研究。
03 实验方法及数据
1. 实验方法：
- 构建PDXs模型；
- 体内药物试验 In vivo drug testing；
- 流式细胞术；
- Sphere-formation assay；
- 荧光杂交(FISH)；
- qPCR；
- 免疫印迹Immunoblotting；
- 免疫组化 Immunohistochemistry (IHC)；
- 免疫荧光 Immunofluorescence (IF)
2. 数据分析
- Bulk transcriptional profiling；
- 对公开的基因表达数据进行分析；
- 外显子组测序及分析；
- 单细胞转录组测序及分析。
3.相关数据：
- SRP100090(PRJNA374893)
- SRP110989(PRJNA392838)：single cell RNA-seq
5个公共数据：
- BRCA1 and familial breast cancers (GSE49481)(Larsen et al., 2014)
- pre/post-chemotherapy (GSE32072)(Gonzalez-Angulo et al., 2012)
- FACS normal mammary cell (GSE16997)(Lim et al., 2009)
- (GSE37223)(Kannan et al., 2013)
- FACS normal mammary cells single-cell qPCR (GSE70554)(Lawson et al., 2015).
主要是看差异表达，还有用GOBO算法看signature scores。
04 研究结果
1
Breast Cancer PDXs Display Variable Response to EGFR Inhibition, Identifying an Exceptional Responder
作者构建了一个主要由TNBC组成的PDXs模型(15/18)，筛选对EGFR抑制剂 gefitinib （吉非替尼）敏感性的队列。结果18个模型中有6个发生了至少50%的肿瘤生长抑制，其中一个敏感性最高(GCRC1735)(图A)。该PDX模型在治疗7个月后肿瘤明显消退，肿瘤无反弹生长(图B)。通过扩大验证，发现结果一致(图C-D)。
PDX模型经过吉非替尼治疗2天后显示了靶向抑制，其特征是pEGFR降低(图E)，pERK下调(图E)，激活了凋亡通路(图F)。第7天表现出增殖抑制(图1G)。
对 GCRC1735 的原发肿瘤进行了组织学、转录组和基因组分析，发现患者携带BRCA1突变(p.C1225Sfs)和体细胞TP53改变(p.R249T)。但EGFR中未发现单核苷酸变异(SNVs)或拷贝数改变(CNAs)。因此，EGFR及其信号通路成员的基因改变不能解释对EGFR抑制的异常反应。
2
Single-Cell RNA Sequencing Identifies EGFR within a Mesenchymal/Stem-like Subpopulation
通过免疫荧光法(IF)，在原发肿瘤和PDX恶性细胞中均观察到EGFR异质表达(图2A)。
为准确了解与异质EGFR表达相关的功能特性，作者在PDX新鲜分离的细胞上进行了单细胞RNA-seq(3,483个细胞，平均每个细胞检测到40,564个独特的分子标识(UMIs)和5,146个基因)。使用来自前5个主要成分的基因进行无监督的基于图的细胞聚类，并使用t-SNE进行可视化。
分为了six subpopulations 六个亚群：
- a mesenchymal/stem(M/S) cluster，表现为 EGFR 和 mesenchymal 相关基因高表达；
- the nuclear/mitochondrial cluster，表现为 nuclear 和 mitochondrial 基因定位高表达；
- a proliferative cluster，表现为细胞周期相关基因高表达；
- the antigen presentation cluster，表现为抗原呈递相关基因高表达；
- the basal cluster，包括 基底细胞表达标记物(KRT6A/B, KRT17, KRT14, and KRT5) 等markers；
- A transitional cluster，差异基因太少，去除。
EGFR高表达细胞亚群其转录特征与不良预后TNBC相关。
3
An EGFR hi Mesenchymal/Stem Subpopulation Is Functionally Enriched for Tumor Potential
通过拟时序分析(Monocle)发现，间充质/干细胞亚群分布于末端分支(图3A)。间充质/干细胞亚群与正常乳腺干细胞特征之间存在显著重叠，并且在正常乳房的基质细胞中间充质/干细胞 Marker 基因和 EGFR 高表达(图3B)，表现了间充质/干细胞亚群的未分化性质，及增强再生能力。
使用荧光激活细胞(FACS)分选EGFRhi和EGFRlo细胞亚群；EGFR表达增强，并且来自间充质/干细胞特征的基因显示其与单细胞测序的特征相同(图3C-D)。
为了证明EGFR细胞是具有更高的成瘤能力，作者分别开展了体内和体外验证试验。与EGFRlo亚群相比，在EGFRhi中ALDH活性增强、球形成效率(SFE)提高(图E-F)，两者都与肿瘤起始能力相关。
通过surrogate实验发现EGERhi成瘤能力更强(图3G)，且 EGERhi细胞形成的原发瘤中，重现了EGFRhi和EGFRlo细胞的异质表达模式(图3H)。未分选的细胞在移植成瘤后出现了EGFRhi和EGFRlo细胞重构(图3I)。
为了检验这些亚群是否反映了不同的遗传亚克隆，作者研究了EGFRhi细胞在克隆肿瘤球中的表达。发现所有由EGFRhi细胞生成的球体都是异质的(图3J)。
这些数据共同支持了一个肿瘤发展的分级模型，其中EGFRhi细胞显示增强的致瘤和转移能力，并且EGFRhi细胞在肿瘤内产生EGFRlo细胞。
吉非替尼诱导的肿瘤消退后，显微观察发现残存着EGFR阳性，吉非替尼耐药细胞亚群，并且这些细胞持续处于非增殖性的EGFR抑制状态，但其保持了启动肿瘤发生的能力，吉非替尼戒断后或将这些细胞再移植给未处理的第二受体小鼠后肿瘤再生长(图3K-P)。
吉非替尼的治疗或培养基中EGF的减少并没有降低SFE，表明EGFR激酶活性对体外TIC存活不是必不可少的(图3q-s)。同样，虽然在吉非替尼的存在下没有明显的肿瘤发生，但在停止治疗后肿瘤出现了生长，表明吉非替尼在体内肿瘤种植过程中并没有抑制TICs的生存，但抑制了TICs的增殖生长(图3T)。这些数据共同支持，EGFRhi抗氧化剂形成了一个肿瘤干细胞层次结构，包括不依赖EGFR活性的自我更新抗氧化剂，以及高度依赖EGFR活性填充肿瘤的EGFRhi肿瘤增殖细胞。
4
EGFR-hi Heterogeneity Associates with TIC Activity in Multiple PDXs
使用免疫荧光评估不同PDX队列中EGFR的表达，发现EGFR表达有异质性也有发现表达均一性(图4A-C)。免疫荧光检测的EGFR的平均表达强度与肿瘤免疫印迹定量显著相关(图4D)。在PDX组中，EGFR异质性与对吉非替尼的敏感性增加相关(图4E)。
在独立的吉非替尼作用乳腺肿瘤模型中，验证EGFR是否与TIC相关：
总之，人类乳腺癌的异质EGFR表达亚型，其与TIC活性和肿瘤的扩增有关。
补充
1. PDXs（Patient-derived xenografts）
人源肿瘤异种移植模型：将病人的肿瘤组织直接移植到免疫缺陷鼠而建立的人源异种移植模型在组织病理学、分子生物学和基因水平上保留了大部分原代肿瘤的特点、具有较好的临床疗效预测性。目前广泛的应用于新药开发，尤其是靶点药物的临床试验病人筛选和预测性生物标志物的研究中。
2. t-SNE
t-SNE(t-distributed stochastic neighbor embedding) 是一种非线性降维算法，非常适用于高维数据降维到2维或者3维，进行可视化。相对于PCA来说，t-SNE可以说是一种更高级有效的方法，目的就是把X(原始高维数据)转换成Z(指定低维度的数据)
3. Monocle-拟时序分析
拟时序分析指的是根据不同细胞亚群基因表达量随一个虚拟时间的变化情况，构建细胞谱系发育。这个虚拟时间是指细胞与细胞之间的转化和演替的顺序和轨迹。
4. 肿瘤起始细胞TICs
Tumor initiating cells，简称TICs。是一类具有自我更新、克隆性肿瘤发生能力和克隆性长期增殖潜能的肿瘤细胞，构成了肿瘤中高度耐药的细胞群体，与肿瘤异质性密切相关，在肿瘤放/化疗初步成功后复发、肿瘤休眠、肿瘤转移和耐药等临床现象中起着关键作用。
