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今天给大家介绍的是于2020年7月29日发表于Scientific Reports的文章，题目为“Unveiling functional heterogeneity in breast cancer multicellular tumor spheroids through single-cell RNA-seq”，作者使用MCF7多细胞肿瘤球体为模型，对不同时间点的球体进行单细胞测序，发现可以分为3个亚群，其中的1个亚群主要作用为促进增殖，其他亚群负责侵袭其他组织。该研究证明了癌症是具有任务分层的细胞群体的系统性单位。Doi:10.1038/s41598-020-69026-7
我们都知道单细胞转录组测序的关注点一直是 （1）异质性； （2）发育； （3）新亚型
研究背景
（1）肿瘤是复杂且异质的系统，并基于遗传变异和多种微环境条件，这些条件会导致对单个细胞水平的治疗反应产生巨大的差异；
（2）从临床角度来看，肿瘤内（肿瘤内部）和肿瘤间（肿瘤之间）异质性是影响患者诊断结果和治疗的关键因素；
（3） 体外模型为从定量方法尤其是与治疗应用相关的的实验评估建立了宝贵的平台；
结果分析
（1）通过生物标志物表达的极化过程。MCF7多细胞肿瘤球体（MCF7 MCTS）能够在体外研究功能异质性与肿瘤进展之间的关系。首先作者将MCF7 MCTS培养19天，并通过在三种不同的培养动力学条件下对测量它们的直径分布。如图1a所示，MCTS直径随时间线性增加。随着肿瘤大小的增加，细胞组成随疾病的自然发展而变化。为了研究随时间变化的肿瘤异质性，作者评估了MKI67和p27的表达，发现6天（D6）和19天（D19）球体之间的MKI67和p27生物标志物表达存在差异。与D19球体细胞相比，几乎所有D6的细胞都过表达MKI67。相反，D19细胞过度表达p27（图1b）。
图 1 肿瘤球体在不同时间点的变化
（2）肿瘤细胞的功能异质性。为了阐明肿瘤中亚群组成与功能多样化之间的联系，作者在发育的第6天和第19天从MCF7 MCTS中进行了单细胞RNA测序，在两个时间点获得了364个细胞的单细胞基因表达谱（13,589个基因）。工作流程如图2所示：
图2 单细胞工作流程
（3）对MCF7 MCTS进行单细胞分析。细胞共分为3个亚群，命名为亚群A-C，每个亚群中的含不同时间点的比例有所区别。亚群A具有约85％的D19细胞，亚群C具有约80％的D6细胞，亚群B为D6和D19细胞的均匀混合物（图3）。
图 3 单细胞分群及比例
（4）基因通路富集分析。作者通过GSEA对过表达基因进行富集分析，图4为亚群A高变基因的富集通路，每个黑色圆圈（节点）代表一条路径，圆圈大小代表基因数量，当2条通路的Jaccard指数≥0.4时，通路之间的联系就建立起来。
图 4 亚群A的通路富集网络分析
亚群A的基因富集通路可以概括为四类：
（1）免疫过程的激活；
（2）鞘脂代谢；
（3）侵袭转移；
（4）细胞死亡信号传导途径。
在免疫过程的激活中具有28个过表达的基因集，这些基因集主要包含被干扰素途径，HIF1-α和Jak信号传导途径的过度激活所激活的基因。入侵和转移类别有11个过表达的基因集，与细胞外基质修饰途径和KRAS信号通路的激活相关。最后，细胞死亡类别包括缺氧和凋亡的途径。根据以上发现，作者认为亚群A可能具有侵袭性和促进存活的作用。
图 5 不同亚群的通路富集网络分析
亚群B的富集通路仅与干扰素应答基因有关。然后作者对不同亚群之间的富集通路进行比较分析发现，与亚群A相比，亚群B的TCA循环和电子呼吸链被过渡激活，以及干扰素应答基因的激活。在与亚群C相比过程中得出相同的结论。根据亚群B中的独特功能，作者认为其可能作为过渡态细胞亚群。
在亚群C中作者发现富集通路主要和细胞周期相关。表明亚群C细胞处于增殖过程中，并过表达细胞周期相关基因如MKI67，FOXM1和TOP2A（图6A）。
图 6 不同亚群差异基因表达
（5）功能异质性的关键基因。图7显示了代表性的差异基因，其中在亚群A中最具代表性的核心基因为CXCL10，参与细胞外基质修饰，Jak信号传导，对干扰素的反应，nup98-hox9融合以及HIF1-α介导的干扰素诱导等细胞通路。亚群C具有典型的增殖标记（MKI67，TOP2A，FOXM1，CDK1），此外，ANLN，ANP32E，RACGAP1和ARHGAP11A也差异表达，并与增殖有关。ANLN的过表达增加了乳腺癌细胞的迁移能力。ANP32E-miR-141轴参与了乳腺癌细胞系中细胞增殖，迁移和侵袭的调控。RACGAP1抑制了基底样乳腺癌细胞系中的细胞迁移，而ARHGAP11A促进了它的迁移。这些观察结果表明，该亚群需要进行代谢重建，以满足癌细胞的能量需求。在图7B中，作者通过IPA分析识别了模序和他们间的调控联系，值得注意的是，这些基因中的大多数是癌症的主要调控因子，所有亚群共同构成了功能异质性的核心。
图 7 差异基因与细胞富集通路关联分析
（6）功能异质性的鲁棒性。先前的结果表明细胞亚组之间的功能异质性， 为了消除由于降维和聚类方法而引起的偏差，作者使用EM聚类算法来重复分析。EM是一种无监督的非参数分类方法，它没有先验地定义样本中亚群的数量。作者发现虽然聚类亚群可能与之前存在不同，但描述的结果和结论没有发生改变。
结论
作者用一张示意图来描述在克隆异质性过程中不同亚群在癌症形成过程中的作用：
图 8 不同时间点下不同细胞亚群的变化
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