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导读
恶性肿瘤是一种世界范围内危害极大的疾病。随着抗肿瘤药物的不断发现以及化疗方案的优化，恶性肿瘤的治愈率随之升高。然而，肿瘤细胞耐药性仍然是抗肿瘤药物治疗的一大障碍。恶性肿瘤的异质性使研究更加困难。近些年，利用单细胞测序技术研究和分析循环肿瘤细胞可以规避肿瘤异质性的干扰并且为探究肿瘤耐药性提供了一个新的前景。
文章信息
文章名：Research and application of single-cell sequencing in tumor heterogeneity and drug resistance of circulating tumor cells 期刊：biomarker research 影响因子：4.866 DOI：10.1186/s40364-020-00240-1
前言
恶性肿瘤是一种发病率逐年升高的常见疾病，已经成为人类健康的一大威胁。近些年，随着抗肿瘤药物的广泛应用，患者五年的生存率大幅度提升。然而，大多数的肿瘤具有耐药性，成为治疗的一大障碍。肿瘤细胞的异质性被认为是耐药性的主要原因。在过去，研究者基于大量混合样本通过高通量测序探究肿瘤细胞的耐药性，忽略了肿瘤细胞的异质性，导致低丰度但是功能非常重要的细胞如循环肿瘤细胞（CTC）的基因特征被淡化。近些年，CTC研究的方法也越来越多样化。因此，对CTC的单细胞测序能够分析单细胞基因组、转录组以及表观遗传学信息，减少肿瘤异质性的干扰，为探究肿瘤耐药性提供新的视野。
结果
1 肿瘤细胞异质性和耐药性之间的关系
近期科学家认为两种机制导致肿瘤耐药：固有耐药和获得性耐药（图1）。固有耐药是在使用抗肿瘤药物之前就存在耐药性，产生于罕见的已经存在的亚克隆。获得性耐药在治疗期间或者治疗后发生，是一种获得的新突变。
在肿瘤细胞多次分裂和增殖后，它们的子代细胞在基因组和生物学特征表现出不一致，这种不一致导致肿瘤细胞的生物学特征不同，成为肿瘤的异质性。肿瘤的异质性被分为肿瘤间异质性和肿瘤内异质性。当前的研究主要关注于肿瘤内的异质性。肿瘤的异质性包括空间异质性和时间异质性（图2）。在肿瘤中，不同空间位点的不同细胞克隆导致空间异质性。肿瘤细胞随着时间改变就是肿瘤细胞的时间异质性。肿瘤细胞也影响基质细胞、免疫细胞和其他细胞，构成了肿瘤微环境（TME）的异质性。大量研究表明肿瘤异质性是肿瘤细胞耐药性的主要原因。例如强烈耐药的细胞在化疗过程中能够逐步替换对药物敏感的细胞。因此研究者需要深入探究肿瘤的异质性。
2 单细胞测序技术在探究肿瘤异质性中的价值
肿瘤细胞的重要信息，如突变体状态、表观状态以及相关蛋白质的表达水平可能在少数或者单个细胞中表达。如果利用混合的肿瘤细胞进行分析就会忽视异质性。在单细胞水平探究肿瘤细胞的耐药性是非常重要的。单细胞测序技术能够在单细胞水平测序基因组和转录组。相较于之前的测序方法，该方法能够更加全面的分析健康细胞和肿瘤细胞，并且鉴定之前未知的细胞类型。因此它能在细胞和分子水平更好的揭示肿瘤细胞的异质性。利用单细胞测序技术探究肿瘤细胞的异质性已经广泛的应用于乳腺癌、黑色素瘤以及肺癌等恶性肿瘤中。
3 CTC的单细胞测序和耐药性
正如之前提及的，肿瘤细胞的异质性，特别是转录组学的信息包括时间和空间的局限，可能是不断变化的。因此，动态探究肿瘤细胞异质性可能会更好的挖掘肿瘤耐药性问题。获取组织标本的主要方法是活体组织切片和细胞穿刺，这是一种侵入性的操作，带有肿瘤扩散的风险，特别是在晚期癌症和发生多个转移的患者中。此外，研究者也由于多个原因不能获取充足符合实验标准质量的样本。CTC是一种从实体瘤原发灶或者转移灶分离得到的肿瘤细胞，能够进入外周血液循环，已经逐步进入人类视野领域。研究证实CTC具有与单细胞测序水平上组织细胞相似的特征。外周血中提取的肿瘤细胞具有侵袭小的优点。在外周血液循环状态下，各种肿瘤类型是相对统一的，更能准确的反映肿瘤细胞时空的异质性。因此，越来越多的研究通过CTC探究肿瘤的耐药性。学者们通过CTC探究绒毛膜癌、结直肠癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、淋巴瘤、胃癌以及其他恶性肿瘤细胞的耐药性。然而目前大多数CTC分析基于CTC上皮生物标记物，而在一些肿瘤类型中上皮生物标记物可能不表达。在基因组水平尚未分析，因而缺乏个体CTC特征或者患者基因组学特征。CTC占血液的一小部分比例，并且仅有十几个CTCs能够在单一时间捕获。从单个细胞中获取的基因材料很小。利用传统的测序方法进行这种研究充满挑战。细胞中微量的原始材料阻碍了肿瘤细胞分析。尽管全基因组扩增（WGA）技术已经发展数十年，之前的WGA技术对于获取高质量基因组扩增信息更加困难。应用单细胞测序技术分析CTC能更加详细的探究基因水平的信息，对肿瘤细胞耐药的相关机制进一步挖掘、准确预测抗肿瘤药物并且制定出更加有效的药物治疗方案。
4 CTC单细胞测序探究肿瘤细胞耐药性机制
近些年，研究者通过单细胞测序技术对CTC进行分析并且发现了肿瘤细胞耐药性的新机制。Miyamoto等人从前列腺癌患者血液样本中分离得到133个CTC，随后进行单细胞RNA测序。之前的研究报道雄激素受体AR信号通路是前列腺癌的一线治疗靶向。然而，Miyamoto等人发现与信号通路相关的AR点突变在去势难治性前列腺癌（CRPC）患者中并不常见。患者间也存在肿瘤异质性导致不同的CTCs具有不同的或者更多的mRNA剪接改变。与未经AR抑制剂恩杂鲁胺治疗的转移型前列腺癌相比，非经典的Wnt信号通路在恩杂鲁胺治疗的前列腺、放射成像或者特异前列腺抗原进展过程的CTC中富集。恩杂鲁胺治疗患者糖皮质激素受体GR表达水平低的CTCs同样富集非经典的Wnt信号。研究发现非经典的Wnt信号通路可能是CRPC耐药性的机制。
间变性淋巴瘤激酶ALK基因在间变性大细胞淋巴瘤亚型中首次发现，负责编码受体酪氨酸激酶PTK。ALK基因中常见的致病突变是基因重排，能够致瘤。ALK基因融合通常发生在非小细胞肺癌NSCLC患者。因此ALK抑制剂应用于治疗这类患者有效。然而，这类病人无一例外的对ALK抑制剂耐药，导致治疗失败。Pailler等人研究了17例ALK重排NSCLC患者CTCs耐药突变体（14例对crizotinib耐药，3例对loratinib耐药），并且在单细胞水平探究了超过48个癌症相关基因以及14个ALK突变体区域。研究者在crizotinib耐药ALK重排患者的CTC中发现基因组的异质性。在不依赖ALK的信号通路中，大鼠肉瘤致癌基因和TP53信号通路发挥重要作用。在loratinib耐药患者中，Pailler鉴定出两个ALK多样的突变体，是一种靶向耐药机制。这些突变体可能是ALK重排和NSCLC对ALK抑制剂耐药的机制。
依据Miyamoto的测序结果，Schissler等人从另一角度探究了前列腺癌耐药的机制并且提出Miyamoto的单细胞测序结果缺乏功能解释，该方法不能完全应用于小群体细胞如CTC。Schissler等人设计了一个实验模型模拟转录的动态变化，通过分析一个生物分子信号通路内细胞与细胞之间聚类的统计学距离来确定与耐药相关的差异表达信号通路。他们设计了一种聚类方法，以细胞为中心的统计学方法，并且证实了该方法在预测单一CTC耐药性中的有效性。研究者发现恩杂鲁胺耐药患者的CTC中有五类信号通路大幅度过表达。Syndecan-4介导的信号转导信号通路在耐药机制中发挥重要作用。
大多数乳腺癌表达雌激素受体ER，因此靶向治疗成为ER阳性乳腺癌治疗的首选。选择性的ER调节因子或者分解因子能被用于靶向ER信号通路，并且芳香化酶抑制剂AI及导致雌激素不足的其他药物也可能用于治疗。研究发现雌激素受体1（ESR1）突变体是肿瘤细胞对AI或者促性腺激素释放激素类似物耐药的机制。Franken等人对46例转移性乳腺癌患者进行CTC单细胞测序，结果发现ESR1突变只出现在接受雌激素剥夺治疗EDT的患者中。相反，在没有接受EDT或者其他治疗的患者中并未检测到突变体。研究者认为新发现的突变体可能导致靶向药物耐药，因为新发现的突变体只存在于接受靶向治疗的患者中并且影响高度保守的氨基酸。Hong等人认为在乳腺癌内分泌疗法耐药的发展过程中基因的和非基因因素之间相互作用，他们利用单细胞RNA测序对肿瘤细胞进行分析，并且发现了对内分泌疗法预耐药的细胞亚群。该亚群在CTC中大量表达。转录重排和拷贝数变化导致的完全耐药也说明存在一个基因和非基因因素相互作用的多步骤的耐药机制。
研究者对结肠癌患者CTC进行单细胞分析发现KRAS突变克隆的出现是结肠癌耐药的第二大机制。研究者在结肠癌患者CTC中也发现另一获得型表皮生长因子受体EGFR细胞外区域突变体（S492R），能够阻断西妥昔单抗（EGFR阻断抗体），建立对西妥昔单抗的耐药。
一些研究充分说明利用单细胞测序技术分析CTC能够更好的探究肿瘤耐药的机制。
5 CTC单细胞测序预测肿瘤细胞耐药性
近期研究者发现肿瘤细胞耐药是一个复杂的生物学行为，伴随持续的进化和肿瘤发展中的动态变化。在这一过程中，多个因素能够影响动态变化的肿瘤细胞的耐药性。利用单细胞测序技术对CTC异常的信号通路进行检测，能够预测耐药性并且实现个性化精准治疗。
恶性肿瘤细胞涉及一系列基因组的改变。包括拷贝数突变CNVs、单核苷酸突变SNVs以及插入/缺失。在肺癌中，及时检测导致耐药的突变体对病人选择合适的治疗方案至关重要。带有EGFR突变体的肺癌最初使用酪氨酸激酶抑制剂治疗良好，但是无一例外的对Gefitinib或者Erlotinib耐药。这种耐药可通过与其他药物联合用药克服。因此，NSCLC患者EGFR表达图谱必须及时检测，为治疗捕获疾病的动态时间变化。Ni等人利用多重退火圆环扩增的方法(MALBAC)有效的解决了CTC中DNA不足的问题，并且实现了全基因组扩增。因此，CNV和SNV能够在单细胞中准确的测量。研究者对11例NSCLC患者进行单细胞基因组测序，发现CTC中含有EGFR突变体基因的患者同样检测到PIK3CA突变。研究发现PIK3CA突变与erlotinib耐药相关。患者在erlotinib治疗后1个月迅速发展为耐药。Ni认为CTC单细胞测序能够有效预测抗肿瘤药物的耐药性，并且促进药物进一步的指导应用。Tan等人对7例NSCLC患者单个CTC也进行了EGFR突变体的检测，例如L858R和T790M。与匹配的肿瘤活组织检测结果比较，结果发现两者高度一致。因此，单细胞分析能够提供更准确的疾病图谱，对于及时检测导致耐药的突变体并且为病人选择合适的治疗方案至关重要。前列腺癌CTC的单细胞测序也得出了类似的结论。对局部高危前列腺患者血液样本中的CTCs进行单细胞研究发现202,241个SNVs以及137,407个插入缺失。研究者探究了CTCs中鉴定出的SNVs对药物应答靶基因的影响，结果发现9个基因突变体与多西他赛的应答相关，且48个SNVs影响24种已知肿瘤药物的药物应答。研究者利用基因集富集分析探究CTC中拷贝数突变CNAs与信号通路之间的关联。结果发现一些影响DNA损伤修复信号通路的基因扩增可能导致化疗耐药。
对于小细胞肺癌而言，目前除了化疗没有令人信服的治疗方案。然而，耐药性也会导致一些治疗失败，一些病人甚至在首次应用化疗药物后就产生了耐药性。临床上，小细胞肺癌患者依据首次化疗3个月内的应答情况分为化疗耐药组和化疗敏感组。在小细胞肺癌中肿瘤细胞极少粘附。CTC的表达特征也高于其他类型肿瘤。Su等人对10例接受etoposide platinum标准化疗方案的小细胞肺癌患者中CTC进行全基因组测序检测。在选择的91个CTCs中，患者CTC的CNA光谱高度一致，也证实CTC可作为肿瘤患者临床相关性分析的理想样本。基于单一CTC测序，研究者建立了一个CNA分值来分析CNA数据与一线化疗有效性和存活之间的关联。Su等人利用CNA分值作为一个标准来预测患者的临床表型，能够准确的预测20/25化疗耐药患者以及15/16化疗敏感患者。同样，Carter等人检测了从13例小细胞肺癌患者中分离得到的88个CTC细胞上的CAN，并且构建了一个基于CNA的分类器，随后检测了18例患者验证了112个CTC细胞，准确率达83.3%。研究充分表明CTC单细胞测序技术可应用于确定患者对化疗药物敏感还是耐药，为实现精准治疗提供理论支撑。
单细胞基因组测序能够提供基因组异质性和细胞谱系信息，而单细胞转录组测序能够更加动态的呈现功能状态下一个物种或者一个特异的细胞所产生的所有RNAs，能够更好的定义所有的细胞类型。Cheng等人利用hydro-seq技术对CTC的转录组进行测序，并且从21例乳腺癌样本中挑选出666个CTCs。乳腺癌的药物靶向包括ER、AR以及人类表皮生长因子受体2都能从CTC中被成功地检测出，对CTCs全转录组分析能够有效的实现对肿瘤细胞异质性的进一步探究。这一发现也证实CTC单细胞转录组测序是分析肿瘤细胞分子特征的有效方法，能够应用于治疗选择和病人检测。
6 CTC单细胞测序探究耐药与TME之间的关联
正如之前报道的，肿瘤异质性是耐药的理论基础。肿瘤异质性不仅受肿瘤细胞自身影响，同时与浸润免疫细胞、形成血管的内皮细胞、肿瘤相关成纤维细胞CAF以及细胞外基质密切相关。这些与肿瘤发展密切相关的内部和外部环境与肿瘤细胞一起构成了TME。因此，TME的研究成为探究肿瘤耐药的重要工具。大量的研究表明TME通过不同的机制影响治疗反应。近期的报道发现TME成纤维细胞可由肿瘤源系外泌体分化为CAFs，促进耐药的表型。细胞外囊泡介导的细胞内通讯在抗肿瘤治疗应答中发挥关键作用。此外，TME来源肿瘤相关巨噬细胞和其他基质细胞可能影响肿瘤耐药。近些年，研究表明CTC的检测反映了其与TME之间的关系以及TME的异质性。随着单细胞测序技术的发展，CTC中应用的技术展现了挖掘耐药性与TME相关联的潜能。Heather等人利用单细胞RNA测序鉴定了14例乳腺癌患者中1707个细胞内两个CTCs群体。依据转录组学分析，CTCs被分为两个亚群：一类在以雌激素应答和增殖升高为特征的转录本中富集，一类在以增殖降低和EMT为特征的转录本中富集。一种细胞-细胞相互作用的工具用以探究CTCs和TME之间的关联。结果发现EMT标记物升高的CTCs具有一个更加多样的相互作用图谱。基因表达信号通路激活分析发现，具有EMT特征的CTC群体活化凋亡信号通路的可能性更低，可能导致耐药性。Heather的研究提示CTC单细胞测序可用于进一步探究肿瘤微环境和肿瘤耐药性。
结论
CTC单细胞测序是一项新兴技术，但是尚未成熟并且存在一些缺陷。例如相较于传统测序，核苷酸原料越少越可能导致生物学噪音。近期，通过转座子插入方法进行的线性扩增可能解决这一问题。另一局限性是可获取的原材料很少。例如，CTC单细胞转录测序，每个细胞平均只包含10 pique总RNA，mRNA只占0.1pique；研究者认为CTC不能在所有肿瘤患者中发现，特别是早期肿瘤患者。因此，CTC单细胞测序仍不能大范围应用。此外，CTC能够完全表达所有肿瘤信息尚存争议并且研究并未发现肿瘤组织和CTC之间存在明显关联。在多大程度上CTC代表相应的肿瘤仍有争议，以致于人们提出将单细胞测序技术与传统的测序技术结合进一步分析结果减少错误。CTC单细胞测序不可避免的导致肿瘤细胞部分空间信息缺失。TME中各种肿瘤细胞与细胞之间相互作用的空间定位对于肿瘤的发展同样重要。单细胞测序是未来探究肿瘤耐药，避免CTC导致空间信息缺失所必需的。
此外，单细胞测序的生物信息学和计算方法仍不能完全匹配对应的数据，新出现的单细胞测序数据使得已有的分析工具显得不切实际。目前，单细胞测序技术也产生了前所未有的数据类型。例如。两种新的测序算法，被认为是恶性肿瘤突变的空间分析方法。因此，数据的扩展也是单细胞分析的一大挑战。
尽管CTC单细胞测序仍不成熟，但是这种跨时代的技术具有它的自然优势，并且我们认为随着全基因组、转录组扩增方法的不断优化以及生物信息学的快速发展，一些问题会逐步解决。CTC单细胞测序有助于探究肿瘤细胞基因异质性和耐药性。CTC单细胞测序一定程度上提供了更加有力的工具来探究肿瘤细胞耐药未解的谜底。
