研究背景
2019年冠状病毒疾病(COVID-19)由严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)感染引起，疾病严重程度与宿主免疫反应之间的关系并没有一个很好的理解。在此，本文对5名健康献血者和13名COVID-19患者的外周血样本进行了单细胞RNA测序，包括中度、重度和恢复期病例。
方法流程
为了表征COVID-19患者的免疫学特征，本文进行了scRNA-seq，研究了13例新冠患者和5例健康捐献者（HDs）的PBMCs的单细胞转录谱共122,542个细胞。将13例COVID-19患者分为三种临床情况：中度(n=7)，重度(n=4)和恢复期（n=6例，其中4例与中度病例配对)。每个受试者也进行单细胞T细胞受体(TCR)和B细胞受体(BCR)测序。
研究结果
1
外周免疫细胞的单细胞转录谱分析
对13例患者和5例健康捐献者的PBMC进行scRNA-seq，共捕获了14种主要细胞类型或亚型的转录体。包括：初始T细胞、激活的T细胞、MAIT、γδ T细胞、增殖的T细胞、NK细胞、B细胞、浆细胞、单核细胞、单核来源树突细胞（mono DCs）、浆状树突细胞、血小板、造血干细胞。
外周免疫细胞的单细胞转录谱分析
2
不同疾病条件下细胞组成的差异
为了揭示三种情况下(中度、重度和恢复期Conv)细胞组成的差异，并与HDs相比，计算了每个个体PBMCs中14种主要细胞类型的相对百分比。在中度患者中，活化的T细胞簇的相对百分比达到峰值，即使在恢复期也没有恢复到正常水平。值得注意的是，初始T细胞、MAIT细胞和单核树突细胞的相对丰度随着疾病的严重程度而降低，后来在Conv患者中恢复。
为了研究SARS-CoV-2感染过程中的抗病毒和致病性免疫反应，评价了在四种情况下主要细胞类型的两种重要途径(GO)的表达水平：干扰素(IFN-α)的反应和急性炎症反应。在COVID-19患者的PBMCs中，所有主要细胞类型对IFN-α的反应都是显著上调的，特别是在重症患者中，几乎每种主要细胞类型都显示最高的值。几种细胞类型显示急性炎症反应的趋势，大致与疾病的严重程度相对应。这些结果提示COVID-19患者有较强的整体促炎反应。
不同疾病条件下细胞组成的差异
3
在天然免疫细胞中观察到强烈的干扰素反应
为进一步研究SARS-CoV-2感染后天然免疫细胞的转录变化，分别比较了中度或重度患者与HD之间的CD14和CD16单核细胞的表达模式。发现显著的差异表达基因(DEGS)参与IFN反应，髓系白细胞活化，细胞因子产生和核因子(NF)κB信号通路，并且NK细胞的表达模式与单核细胞类似，提示天然免疫细胞对SARS-CoV-2感染的应答反应是一致的。这些结果表明，COVID-19患者的大多数天然免疫细胞类型表现出强烈的IFN反应。
在天然免疫细胞中观察到强烈的干扰素反应
4
COVID-19患者T细胞亚群的特点
为了表征个体间T细胞亚群在四种条件下的变化，从PBMCs中对T细胞进行亚型细分，得到了12个亚群。为了深入了解4种样本T细胞亚群的特征，评估了每个亚群在四个条件下的分布。值得注意的是，与HDs相比，COVID-19患者CD4初始、CD4记忆、CD4效应记忆、Treg、CD8初始和NKT初始亚群的比例下降，相反，COVID-19患者的激活状态T细胞亚群比例增加，包括CD4效应，CD8效应，NKT亚群。特别值得注意的是，CD4效应亚群在HDs中几乎没有，但在中度、重度和Conv患者中高度富集。
差异基因通路富集分析，发现COVID-19患者的差异基因上调，参与了IFN反应、细胞因子产生、细胞杀伤、白细胞粘附等过程。
COVID-19患者T细胞亚群的特点
5
单细胞TCR测序展示T细胞的克隆扩增
接下来，为了了解单个T细胞之间的克隆关系和V(D)J基因在四种条件下重排情况，对T细胞进行TCR测序。与HDs相比，COVID-19患者和恢复期患者的克隆扩张明显，并且中度和Conv条件下高于重度条件下。同时，在重度条件下，没有严重的克隆扩张，提示重症患者可能缺乏有效的效应T细胞克隆扩增。
为了研究COVID-19和患者TCRs的动力学和基因偏好，比较了四种情况下V(D)J的情况。前10个互补决定区域3(CDR3)序列在四个条件下是不同的，表明不同的免疫显性表位可能驱动T细胞反应的分子组成，并可能与SARS-CoV-2特异性感染有关。
单细胞TCR测序展示T细胞的克隆扩增
6
COVID-19患者B细胞亚群的特点
为了追踪不同B细胞亚型的动态变化，根据典型B细胞标记的表达和分布，将B细胞细分为6个亚群。值得注意的是，与HD相比，COVID-19患者的激活状态B亚群，包括生发中心B、浆细胞及其亚群的比例增加，相反，与HD相比，COVID-19患者的记忆B细胞比例下降。为了进一步研究SARS-CoV-2感染后B细胞的差异转录变化，比较了中度或重度B/浆细胞的表达谱， 在COVID-19患者中最显著富集的差异基因参与了IFN反应。
COVID-19患者B细胞亚群的特点
7
单细胞BCR测序展示重症患者B细胞的克隆扩增特点
来自重症患者的B细胞表现出明显的克隆扩张，表明B细胞活性和体液免疫反应在重症患者中被强烈激活，表明较高的抗体滴度与更差的临床结果有关。接下来评估了IgA、IgD、IgG和IgM在中度、重度和Conv条件下的分布，IgM是主要的免疫球蛋白，与HD相比，COVID-19患者IgG丰度增加，而IgM降低。在恢复期患者中，IgG和IgM的水平恢复到与HD相似的水平。
为了研究BCR的偏置V(D)J重排，比较了四种情况下V(D)J的情况, 与其他三种情况相比，发现在严重情况下V(D)J重排更加特异，表明B细胞在严重情况下可能经历独特的V(D)J重排。值得注意的是，在重症患者中选择性使用显性IGV基因，特别是IGHV3-7和IGKV3-15，可能有助于疫苗的设计。
单细胞BCR测序展示重症患者B细胞的克隆扩增特点
研究结论
总之，在这项研究中，这种综合的、多细胞的描述为未来表征对SARS-CoV-2感染的复杂、动态免疫反应奠定了基础。详细的TCR和BCR为基础的谱系信息，可以帮助更深入了解COVID-19患者外周淋巴细胞，为合理的治疗以及SARS-CoV-2特异性疫苗的设计铺平道路。
参考文献
Zhang JY, Wang XM, Xing X, et al. Single-cell landscape of immunological responses in patients with COVID-19 [published online ahead of print, 2020 Aug 12]. Nat Immunol.2020;10.1038/s41590-020-0762-x. doi:10.1038/s41590-020-0762-x.
长按二维码发现惊喜
独阅乐不如众阅乐
