胃癌(GC)虽然根治性切除和全身化疗已经有了很大的改善，但由于恶性增殖和转移，其预后仍然很差。因此，迫切需要阐明胃癌进展的潜在分子机制，这将有助于靶向治疗的发展。M6A甲基化是真核mRNAs中最普遍的修饰之一。之前的研究报道，m6A修饰的作用包括调节mRNA的稳定性、剪接和翻译。甲基转移酶3(METTL3)是一种催化酶，能促进mRNAs的m6A修饰。今天笔者带来一篇文章详细研究了METTL3介导BATF2的m6A修饰影响胃癌进展。这篇文章发表于2020年7月发表在Molecular Cancer（IF=15.3）上，文章研究思路清晰，实验结果交叉验证，细致又严谨，对于梳理肿瘤和m6A思路是一篇非常好的研究。
1.临床病例分析—胃癌患者BATF2表达降低与预后不良相关
作者通过转录组测序在8对胃癌和癌旁组织中鉴定出BATF2为下调基因并用于后续实验。随后在mRNA和蛋白水平验证其在癌组织中高表。临床病例显示BATF2低表患者总生存率明显低于高表达患者。并且BATF2低表达与腹膜复发率显著相关，BATF2在无腹膜复发的组织中的表达更高。
2.细胞表型研究—BATF2在体内外对胃癌生长的抑制作用
之后作者建立了过表和敲降BATF2的GC细胞系，来研究BATF2的功能。BATF2的上调显著抑制了GC细胞增殖，敲降细胞结果相反。流式细胞仪分析细胞周期分布的评估显示过表细胞多数处于G1期，而敲降细胞则相反。动物实验同样验证BATF2高表达的肿瘤移植物生长更慢。所以BATF2可能通过调节细胞周期抑制胃癌生长。
3.细胞表型研究—BATF2对体内外胃癌转移的调控作用
细胞迁移和侵袭实验表明，BATF2的高表达显著抑制了肿瘤细胞的迁移和侵袭。将肿瘤细胞经尾静脉注射到裸鼠体内，过表达BATF2组的GC肺转移显著减少，低表组GC肺转移显著增加，且有更多转移结节，腹膜转移也显著增强。结果表明BATF2在抑制胃癌转移中有关键作用。
4.信号通路研究—BATF2通过ERK信号抑制GC
作者研究信号通路时，首先进行GSEA富集，显示BATF2与MAPK信号通路相关。利用基因芯片分析出BATF2基因敲除显著促进ERK磷酸化，而过表达BATF2则降低ERK磷酸化，Western blot和动物荷瘤p-ERK染色验证。随后作者用MEK/ERK特异性抑制剂处理BATF2基因敲除细胞，发现抑制p-ERK可消除细胞增殖，迁移和侵袭。此外，抑制剂有效地降低了p-ERK及其下游靶点的水平。最后作者回归临床，发现BATF2的预后价值依赖于p-ERK的表达。这些数据表明，BATF2介导的ERK磷酸化变化可能是BATF2在胃癌中发挥抑瘤作用的机制。
5.下游分子机制研究—BATF2在p53存在的情况下调控ERK磷酸化
之后作者使用STRING数据库分析出P53蛋白与BATF2相互作用。同时实验验证BATF2过表达导致p53蛋白表达增加，而敲降BATF2则降低p53表达。然而，qRT-PCR分析它们在转录水平上没有明显的相关性。免疫荧光染色发现BATF2与p53在GC细胞中共存。CO-IP分析表明BATF2和p53蛋白相互作用。因此，作者推测BATF2可能通过翻译后修饰来调节p53蛋白水平。随后，作者向蛋白稳定性方面探究，使用翻译抑制剂CHX后，BATF2过表达显著增加了p53蛋白的半衰期。蛋白酶体抑制剂MG132挽救了BATF2过表达引起的p53蛋白水平的变化。同时敲降p53后恢复了高表BATF2的增殖和转移能力，并且促进ERK磷酸化及其下游基因的表达。所以BATF2的缺失促进了泛素化介导的p53降解，从而激活了ERK信号。
6.下游分子机制研究—METTL3介导的胃癌细胞BATF2 mRNA的m6A修饰
作者想要探究N6-甲基腺苷(m6A)修饰是否调节了BATF2的mRNA稳定性。随后沉默m6A甲基转移酶METTL3的表达，结果增加BATF2的表达，并且BATF2 mRNA的m6A修饰与METTL3的表达呈正相关，METTL3与BATF2呈负相关。在线预测工具SRAMP显示，在BATF2的3’UTR上分布着大量m6A位点。作者构建了三个突变的BATF2的3‘UTR质粒，利用荧光素酶报告实验确定METTL3主要通过MUT3位点调控BATF2的表达。这些结果表明，METTL3在GC中通过m6A维持了BATF2 mRNA的稳定性。
研究思路
