线粒体在代谢过程中具有非常关键的作用，而且由于线粒体具有独立的基因组而成为非常独特的细胞器。线粒体中的基因组通常具有很高的拷贝数并且编码一系列与线粒体功能相关的蛋白质、tRNAs以及核糖体RNAs。线粒体基因组突变与多种临床疾病相关，据估计在人群中约1/4300受到线粒体DNA突变的影响，这使得线粒体疾病成为最常见的遗传性代谢疾病之一【1】。自然存在的线粒体DNA突变可以推断细胞间的克隆关系。线粒体DNA与细胞状态可以被同时测量和描述，但是目前为止还没有能够对复杂人体组织进行大规模并行处理的单细胞测序方法。为了解决这一问题，哈佛医学院Vijay G. Sankaran研究组、Broad研究所Aviv Regev研究组、Caleb A. Lareau以及Leif S. Ludwig合作发文题为Massively parallel single-cell mitochondrial DNA genotyping and chromatin profiling，将高置信度的线粒体DNA突变检测技术与高质量染色质可及性分析技术进行合并建立了高通量的、基于的10x Genomics平台以液滴为基础的（Droplet-based）线粒体DNA单细胞转座酶染色质可及性测序技术mtscATAC-seq（Mitochondrial single-cell assay for transposase-accessible chromatin with sequencing）。
为了建立mtscATAC-seq技术，作者们首先对业内广泛使用的10x Genomics平台中基于液滴的scATAC-seq技术的工作流程进行优化。根据最近的研究，基于液滴的scATAC-seq技术能够在每个实验组中对数千个细胞的染色质可及性进行分析【2】。因此，通过对该实验流程的优化可能有助于富集转座酶可及性的线粒体DNA。但是目前的实验方法依赖于对细胞核的处理，会消耗和损伤线粒体，最终只有1%的reads能够映射到线粒体DNA，而这一测序深度对于单细胞内线粒体DNA突变的评估以及克隆起源的推断是远远不够的。
为了对该实验方法进行优化，作者们进行了以下的考量。首先，作者们认为ATAC-seq中所使用的转座酶Tn5酶需要对细胞进行轻微的裂解或透化（Permeabilization）处理将适配子（Adapter）整合到开放的染色质和线粒体DNA中。另外，细胞内包含多个线粒体，在裂解或者透化过程中需要进行固定以防止细胞内线粒体DNA的混合。最后，作者们希望能够实验测试出保持高质量染色质可及性数据的实验条件。
作者们通过对线粒体DNA的丰度、交叉污染的程度以及线粒体DNA与染色质片段复杂性等方面的评估系统性地检测了符合以上条件的scATAC-seq实验方法。作者们发现裂解液以及洗脱液中包含Omitting洋地黄皂苷以及Tween-20的实验条件Condition A可以最大程度在单细胞中获得线粒体DNA（图1）。与推荐实验方案的获取率1.9%相比，Condition A的获取丰度可以达到中位数21.5%。另外，作者们发现用0.1%或1%的甲醛固定可以使线粒体DNA片段交叉污染减少3倍，而且甲醛固定不会引入额外的线粒体DNA突变。为了进一步提高测序结果在线粒体基因组上的覆盖率，作者们因此开发了一种计算方法，可以有效地分配到线粒体和核基因组严格到线粒体DNA的映射，促进几乎达到全覆盖而不改变染色质的复杂性的实验目的。
图1 系统性检测符合获得高质量高通量线粒体DNA可及性的实验条件
根据以上的优化条件，作者们通过合并固定、优化裂解方式以及增加计算分析方法建立了mtscATAC-seq高通量单细胞染色质可及性测序技术，每个细胞中平均线粒体DNA的覆盖以及reads增加了20倍之多。
为了验证mtscATAC-seq该方法的稳健性与高效性，作者们对不同的实验样品进行测试。首先作者们希望用该方法对致病性的线粒体DNA突变进行鉴定同时对这些突变带来的影响进行分析。为此，作者们对伴红色粗糙纤维肌阵挛性癫痫患者中的类淋巴母细胞进行检测，该线粒体疾病主要是由于细胞中包含会改变tRNA功能的突变3。通过对细胞大量的ATAC-seq实验的分析作者们确认了样品中突变异质性的存在，这前人的工作结果一致【4】。另外，作者们对线粒体中存在的另外一个突变进行分析后发现，覆盖两种突变所有5230个reads中，99.6%的比例同时包括两种突变或者是两种突变都不包括的野生型。这些结果说明mtscATAC-seq可以通过对线粒体不同突变的检测提高对于线粒体疾病相关的细胞谱系分析的能力。
进一步地，作者们建立了一个线粒体基因组分析工具箱（Mitochondrial Genome Analysis Toolkit，mgatk），可以通过mtscATAC-seq对复杂的细胞群体中的克隆结构进行鉴定以及通过高通量的、高质量的方法对单细胞状态相关的线粒体DNA变体进行分析。另外，作者们也使用mtscATAC-seq技术对体内和体外的造血干细胞谱系进行克隆追踪。
总的来说，该工作开发出了一个用于鉴定和测量线粒体DNA突变异质性并同时获得染色质开放状态的高通量平台，可以用于评估克隆结构、利用线粒体DNA变异推断肿瘤内的异质性并对体内体外的造血过程的克隆动态进行评估。与传统的高通量scRNA-seq方法相比mtscATAC-seq技术大大提高了获取线粒体DNA的丰度、增加对线粒体DNA变体的测序深度同时可以用于分析复杂的患者组织样本。
参考文献
1.Stewart, J. B. & Chinnery, P. F. The dynamics of mitochondrial DNA heteroplasmy: implications for human health and disease. Nature reviews. Genetics 16, 530-542, doi:10.1038/nrg3966 (2015).
2.Satpathy, A. T. et al. Massively parallel single-cell chromatin landscapes of human immune cell development and intratumoral T cell exhaustion. Nature biotechnology 37, 925-936, doi:10.1038/s41587-019-0206-z (2019).
3.Shoffner, J. M. & Wallace, D. C. Mitochondrial genetics: principles and practice. American journal of human genetics 51, 1179-1186 (1992).
4.Dames, S. et al. The development of next-generation sequencing assays for the mitochondrial genome and 108 nuclear genes associated with mitochondrial disorders. The Journal of molecular diagnostics : JMD 15, 526-534, doi:10.1016/j.jmoldx.2013.03.005 (2013).
