分享是一种态度
作者 | 周运来
男，
一个长大了才会遇到的帅哥，
稳健，潇洒，大方，靠谱。
一段生信缘，一棵技能树，
一枚大型测序工厂的螺丝钉，
一个随机森林中提灯觅食的津门旅客。
单细胞是什么？
单细胞指的是一个水平和层次，当然为给我们的读者一个清晰的认识，我们举一个不值一提的例子：
Single cell transcriptome profiling (scRNA-seq) has enabled high resolution mapping of cellular heterogeneity, development, and activation states in diverse systems.
在单个细胞水平上可以研究RNA当然也可以研究，看每个细胞中的基因表达情况，那么，其他单个细胞有意思的现象也是可以研究的吧？于是，当我们听到ecDNA这个很厉害的东西，不禁会想：
什么是ecDNA?
2019年的时候各大公众号都发布了相关的新闻，一时间，ecDNA成为科研新星。
Circular ecDNA promotes accessible chromatin and high oncogene expression
染色体外DNA (Extrachromosomal DNA，ecDNA)是一种独特的环状DNA，含有位于细胞染色体外的功能基因，可以自我复制很多次。ecDNA在癌细胞内快速复制，导致大量的癌基因拷贝，这种特性可以在细胞分裂时以非对称（随机）的方式传递给子细胞。癌细胞可以上调或下调位于ecDNA上的癌基因，以确保其在化疗、靶向治疗、免疫治疗或放疗等选择压力下生存，使ecDNA成为癌症细胞复发和治疗耐药的主要机制之一。ecDNA在健康细胞中很少见到，但在许多实体肿瘤中发现。它们是最具侵略性和最难治疗的癌症的关键驱动因素，特别是那些以高拷贝数扩增癌基因为特征的癌症。
Frequency of circular amplification across tumor and non-tumor tissues
在3731个肿瘤和匹配的非肿瘤性样本中，环状ecDNA和其他扩增类型的分布，包括断裂融合桥(BFB)、重排列扩增子、线性扩增和未检测到的局灶性体细胞拷贝数扩增(no - fscna)。
大佬说了：
We also find that patients whose cancers have ecDNA have significantly shorter survival than all other cancer patients, whose tumors are driven by other molecular lesions, even when grouped by tumor type." ------ Dr. Paul Mischel, one of the study's authors and a distinguished professor at the UC San Diego School of Medicine and a member of the Ludwig Institute for Cancer Research
在肿瘤中可以检测到ecDNA，这似乎是癌细胞独有的。以前称为双微体( double minutes)，但是现在被称为染色体外的DNA (ecDNA)，因为他们通常不对比这些ecDNA粒子通常是非常大的(平均大小1.3 Mb)，每个细胞多拷贝，并包含许多基因和调控区域，致癌基因有明显富集。重要的是，在癌细胞中ecDNAs似乎比它们在染色体上的对等物更具有转录活性，并被怀疑赋予癌细胞生长和生存优势。
在调研的过程中，我们发现细胞核中的DNA以线形染色体的形式排列。多年来，研究人员观察到在染色体旁边有更小长度的DNA，它们以圆形的形式排列。其中一些被称为染色体外环DNA (extrachromosomal circular DNA，eccDNAs)或微DNA的颗粒通常较小(<1 kb)、基因稀疏且未扩增。通过核型分析在癌症中可见的长eccDNAs，也就是ecDNAs，已知其携带癌基因，经放大可促进癌症的发生。最近的研究结果表明，在正常细胞和癌细胞系中，有大量小于1000 bp的较小的eccnas构成了90%的eccDNA。癌细胞中还含有较长的外链dna，它们的大小从1kb到 double minutes不等，但通过核型分析并不总是可见。
ecDNA的特点：
- ecDNAs似乎是癌症特有的，或者至少我们还没有在正常细胞中看到它，
- ecDNAs通过其非孟德尔、非染色体遗传机制，驱动高癌基因拷贝数，维持瘤内遗传异质性;
- ecDNAs由于这种遗传机制，可以迅速改变其基因组，包括逃避治疗;
- ecDNA的高DNA模板水平，加上改变的染色质结构，驱动大量的癌基因转录，并可能以促进肿瘤发生的方式重塑表观基因组。
ecDNA在驱动一些恶性癌症的侵袭行为方面发挥了关键作用:
- 由于ecDNAs缺乏着丝粒，它们受制于非孟德尔遗传(即非染色体)，这使得肿瘤在保持瘤内遗传异质性的同时实现非常高的癌基因拷贝数;
- 这种遗传机制产生的瘤内遗传异质性使肿瘤能够迅速进化，以应对不断变化的条件，包括治疗，这就解释了某些癌症以无法用染色体遗传解释的速度改变其基因组的显著能力;
- 通过非孟德尔遗传和选择获得的高DNA模板水平，加上我们论证的(与Howard Chang博士密切合作完成的工作中确认的)圆形结构产生的染色质组织改变，导致大量癌基因转录。
ecNDA 是细胞类型特异的吗？
通过以上的调研，不难发现ecDNA是肿瘤细胞中特有的一种环状DNA。问题来了：
- 各种肿瘤细胞都有ecDNA吗？
- 同一种肿瘤中每个细胞的ecNDA一样吗？
显然，是否定的。
换句话说，ecNDA也是肿瘤样本异质性的反映。这么，在单个细胞水平来测ecNDA也就有现实意义了。但是，单细胞ecNDA是可测的吗？
参考一般单细胞产品的路线，我们可以这样想：
- 在bulk中ecDNA是如何测的？
- 单细胞捕获体系的选择
- 在该体系下测ecDNA
- 获得单细胞水平的ecDNA
DNA Electrophoresis
Circle-Seq的技术原理是，首先富集得到样品中的DNA，随后利用外切酶去除线性基因组DNA，得到Circular DNA，对Circular DNA循环扩增后进行超声打断、建库测序及测序数据的分析。
考虑到ecDNA是环状的特点，所以：
要打好这张单细胞的牌，还需要组合更多基础技术。
Koche R P, Rodriguez-Fos E, Helmsauer K, et al. Extrachromosomal circular DNA drives oncogenic genome remodeling in neuroblastoma. Nature Genetics(2019).
Verhaak, R. G. W., Bafna, V. & Mischel, P. S. Extrachromosomal oncogene amplification in tumour pathogenesis and evolution.Nat. Rev. Cancer (2019).
Sin S T K, Jiang P, Deng J, et al. Identification and characterization of extrachromosomal circular DNA in maternal plasma. Proceedings of the National Academy of Sciences(2020).
Wu S, Turner K M, Nguyen N, et al. Circular ecDNA promotes accessible chromatin and high oncogene expression. Nature (2019).
Prada-Luengo, I., Krogh, A., Maretty, L. et al. Sensitive detection of circular DNAs at single-nucleotide resolution using guided realignment of partially aligned reads. BMC Bioinformatics 20, 663 (2019).
Multiplication of ecDNA genes present in many cancer types, drives poor patients outcomes(https://www.news-medical.net/news/20200817/Multiplication-of-ecDNA-genes-present-in-many-cancer-types-drives-poor-patients-outcomes.aspx#:~:text=Extrachromosomal DNA, or ecDNA, are distinct circular units,daughter cells in asymmetric ways during cell division.)
What Is Extrachromosomal Circular DNA and What Does It Do?(https://academic.oup.com/clinchem/article/66/6/754/5848613)
往期回顾
scRNA-seq Clustering quality control（二）
CNS图表复现09—上皮细胞可以区分为恶性与否
单细胞初级8讲和高级分析8讲
