在恶性肿瘤的临床治疗中，靶向CTLA-4/PD-1/PD-L1等位点的单克隆抗体表现出了令人欣喜的抑制效果，但同时患者也出现了严重的免疫相关不良反应（immune-related adverse events, irAEs）。这些irAEs轻则引发炎症反应，重则导致身体脏器功能衰竭，据统计在PD-1/CTLA-4抗体治疗患者中约60%病人出现了严重的治疗毒性反应，因此极大地限制了免疫检查点抑制剂抗体的临床使用。
在肿瘤免疫治疗的临床研究中，常常可见irAEs反应，其分子机制目前仍不清楚，目前了解到irAEs病灶常见于胃肠黏膜、肝脏、皮肤和肺部组织。免疫抑制剂诱发（Checkpoint inhibitor-induced, CPI）的结肠炎（ CPI colitis）属irAEs反应中最为常见的病症，特别是在ipilimumab（anti-CTLA-4 mAb）和nivolumab（anti-PD-1 mAb）治疗患者中。
在肠道组织中，CTLA-4相比于PD-1分子表现出更重要的维持稳态的作用。在接受ipilimumab治疗的患者体内，常常可观察到轻微的结肠炎病症，严重的 CPI colitis患者所占比例略少，但也有约10%-20%，并且严重时可危及患者生命。目前对于 CPI colitis的临床治疗方案一般是使用高剂量的皮质类固醇corticosteroids，corticosteroids的抗肿瘤反应机理目前仍未可知，我们仅知道其可以诱导增殖性T细胞凋亡。
由于colitis在小鼠模型中没有免疫反应表现，导致了irAEs免疫损伤机理的研究开展较为困难。近日来自Harvard医学院、麻省总医院和Dana-Farber癌症研究所的研究者们采用索尼全光谱流式技术（spectral flow cytometry）和单细胞RNA测序技术（scRNA-seq），对 CPI colitis病人进行了蛋白组学和基因组学两个层级的功能表型鉴定，探索了irAEs反应中各免疫细胞亚群的表型动态变化，力图筛选出可供介入治疗的潜在信号靶点。
队列研究思路
图1. CPI colitis单细胞组学与biopsy组织采样分析流程
作者设置了三组研究对象：黑色素瘤患者伴发 CPI colitis（8人），黑色素瘤患者无 CPI colitis炎症伴发（6人），以及健康对照组（8人）。所有 CPI组患者均注射了CTLA-4与PD-1抗体，其中每组余一人仅注射anti-CTLA-4 mAb。当colitis病症出现后，立即对肠粘膜三个部位（rectum，sigmoidal和descending）进行活检确认，同时对粘膜固有层和肠上皮层组织采样制备单细胞悬液，流式分选CD45 CD3 细胞用于单细胞RNA测序，结合光谱流式多色panel检测marker表达变化。
CPI Colitis炎症组织中免疫动态变化
图2. CD45 免疫亚群动态分布
通过分析16个样本中CD45 细胞scRNA-seq数据的转录组表达差异，可将CD45 细胞细分为16个表型亚群，包括常见的T cells, B cells, IgA plasma B cells, myeloid cells, mast cells和innate lympoid cells。 CPI colitis组与对照组的显著差异在于T细胞亚群的比例变化，特别是CD8 毒性淋巴细胞(CTL)和cycling T cells两个亚群。光谱流式分析结果同样显示， CPI colitis组CD3 亚群比例出现明显上升。
图3. CD8 T细胞毒性功能与活化功能表征
由于CTL细胞出现显著性增多，研究者深入分析发现CTL细胞可继续细分为8个亚群：cluster 7（毒性效应细胞）和cluster 8（cycling T cells）在 CPI colitis组具有独占性分布表现，上述两群细胞具有毒性蛋白基因高转录活性，包括GZMB和IFNγ应答基因（HLA-DRA & CD74）；另有cluster 5/6（中枢记忆/幼稚细胞；终末效应细胞）同样出现显著性增多，而组织驻留记忆T (Trm)细胞比例明显降低。
接受了ipilimumab治疗的colitis患者同样出现高比例的granzyme B CD8 T cells，表明毒性CD8 T cells亚群的动态变化与免疫抑制剂的使用并没有严密联系。结合scRNA-seq数据分析，研究者用光谱流式确认了相关免疫亚群的表型变化： CPI colitis组cycling (Ki-67 ) granzyme B CD8 T cells比例明显上调，同时Trm亚群比例显著下降，与基因水平的表达变化一致。
图4. CD4 效应细胞与Treg细胞亚群分布
与CTL亚群类似，CD4 T cells可细分为10个亚群，其中cluster 9（Th1 effectors）和 clusters10（Treg cells）在 CPI Colitis组占据绝对主导。CTLA-4高表达于FoxP3 Treg cells中，尽管目前还未有临床数据，但理论上针对CTLA-4 Treg cells的耗竭处理可引起严重的irAEs反应。在本文研究中，光谱流式分析结果显示 CPI colitis组FoxP3 亚群比例显著上调， FoxP3蛋白表达量同样明显上调。
图5. FoxP3 Treg亚群中CTLA-4表达变化
T细胞亚群抑制信号状态变化
图6. CD8 T亚群中CTLA-4表达变化
接着作者检测了炎症环境中CD4 /CD8 T细胞的抑制信号受体表达情况，colitis 组CD4 /CD8 T细胞CTLA-4基因明显表达更为活跃，同时流式也可检测到 CPI colitis组CD8 T细胞高表达granzyme B和CTLA-4，从蛋白组水平提供了CTLA-4信号的活化证据。作为近年来的热门靶点，靶向TIM-3和LAG-3的抗体研究愈加受肿瘤免疫治疗方案的重视，本文结果也证实， CPI colitis组中CD8 T细胞中TIM-3和LAG-3的编码基因HAVCR2和LAG3表现出显著性表达上调。
通过筛选colitis炎症中的分子信号反应，研究者找到了毒性基因GZMB和GNLY (CD8 T cells) 以及 GZMA (CD4 T cells)在对照组和colitis 组中的显著性差异表达，暗示了其有作为介入靶点的潜力；同时IFNγ信号也表现出了明显的表达上调，作为IFNγ信号通路的下游，T细胞激活也将增强GBP5与MHC II所负责的抗原呈递通路（HLA-DR/CD74）。
图7. 髓系亚群中炎症反应相关因子表达变化
通过对所有CD45 细胞的表达分析，作者发现colitis 组髓系细胞群中IFNγ和TNFα信号显著增强，包括编码趋化因子的CXCL9和CXCL10，可有效募集CXCR3 效应T细胞至炎症位点发挥杀伤能力。髓系细胞可分为三个巨噬/单核亚群，一个DC亚群和一个吞噬T亚群。 CPI colitis组Cluster 1 (macrophage)表现出高表达IFNγ信号水平，包括CXCL9和CXCL10因子；同时cluster 1也表现出明显的TNFα信号表达，说明了IFNγ信号可调控髓系细胞的趋化因子表达水平，具有募集效应T细胞至炎症中心的促进作用。
潜在信号通路的介入靶点分析
图8. CD45 免疫体系中趋化因子受体与细胞因子所属活化亚群分析
基于以上研究数据，研究者分析总结了两条可能的 CPI colitis炎症治疗分子机制：T细胞募集活化途径和可溶性炎症调控因子途径。
1）T细胞募集需要趋化因子受体CXCR3和CXCR6的协同作用，两者均高表达于 CPI colitis组；αEβ7 integrin作为Trm T细胞特征marker，可增强T细胞对E-cadherin 上皮细胞的黏附作用，也可促进T细胞从血液浸润至肠道中。已有临床数据显示靶向αEβ7 integrin的抗体药物vedolizumab，具有显著的 CPI colitis抑制效果。
2） CPI colitis组表现出多种细胞因子的信号激活，包括TNF，IL1B以及OSM。临床数据表明TNFα信号抑制可显著降低 CPI colitis炎症反应，反之TNFα信号活化可增强 CPI colitis炎症作用；NLRP3炎症小体的活化可刺激IL-1的表达释放，同样有临床实验证实，使用靶向IL1-β的抗体药物canakinumab可有效抑制肿瘤发生。
光谱流式多色panel检测优势
本文同时使用了基因组学和蛋白组学两种方法，对 CPI colitis免疫状态变化进行了细致入微的表征研究。在本篇研究的蛋白组学分析中，为验证scRNA-seq结果作者设计了15色的流式多色panel，从蛋白组学角度为测序结果提供了细胞功能表型数据的有力补充。作者选择了Sony SP6800全光谱流式分析仪为检测平台，对10个表面marker以及4个胞内marker做了探索分析。得益于全光谱流式技术，SP6800可以实现胞内弱表达marker全部荧光发射信号的连续收集，结合优化改进的数学算法（加权最小二乘法），以客观无偏差的光谱解析方式呈现出分群更加清晰明确的荧光表达信号。
光谱流式SP6800胞内marker表达检测数据
总结
通过单细胞测序以及光谱流式多色panel检测，作者分别从基因组学水平和蛋白组学水平表征鉴定了 CPI colitis患者炎症组织中免疫细胞亚群的动态变化，以及效应T细胞的免疫因子分泌功能和毒性杀伤能力的变化调控，为 CPI colitis以及其他irAEs反应的免疫治疗提供了大量翔实丰富的临床数据，有助于相关领域学者继续寻找可能的潜在介入治疗靶点。
Reference:
Luoma et al., Molecular Pathways of Colon Inflammation Induced by Cancer Immunotherapy, Cell (2020), https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.06.001
