前面我在《生信技能树》的教程：什么，你感兴趣的GEO数据集没有关联到原始文献出处，提到了一个GSE数据集是可以关联到很多文献，如果这个数据集被挖掘过。但是举例子的时候留空白了，居然被眼尖的读者指出来了。其实写教程有时候很耗费时间，我不想为了一个教程再去临时查询资料做整理，但是即使不举例，相信大家也是能看懂的。 恰好我最近看到了一个数据集就关联到了3个文章，数据在：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE66313
很简单的设计，就是450K甲基化芯片：DCIS (n=40) and adjacent normal (n=15) ，另外的信息技术：Among 40 DCIS cases 13 later developed invasive disease
实验结论很清晰：This work contributes to the understanding of epigenetic alterations that occur in DCIS and illustrates the potential of DNA methylation as markers of DCIS progression.
文章包括：
- DNA methylation in ductal carcinoma in situ related with future development of invasive breast cancer. Clin Epigenetics 2015;7:75. PMID: 26213588
- Concordance of DNA methylation profiles between breast core biopsy and surgical excision specimens containing ductal carcinoma in situ (DCIS). Exp Mol Pathol 2017 Aug;103(1):78-83. PMID: 28711544
- Genome-wide characterization of cytosine-specific 5-hydroxymethylation in normal breast tissue. Epigenetics 2020 Apr;15(4):398-418. PMID: 31842685
学徒作业（一）
这3个文章都需要写文献解读，参考解读模式见：
文献解读示例
多个GSE数据集，走差异基因路线
比如下面3篇文章，都是关于肺癌的数据挖掘文章，而且是整合多个GSE数据集，走的是差异基因路线。
首先需要理解肺癌的生物学背景知识，组织病理上通常将肺癌分为
- 非小细胞肺癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC）
- 小细胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）
其中SCLC约占全部肺癌的15%~20%，SCLC的发病与吸烟密切相关，生物学特征为分化程度低、恶性程度高、倍增时间快、侵袭性强、预后差，中位生存期才7个月左右。
其中NSCLC又可以区分为LUSC和LUAD，鳞癌和腺癌的差异。
第一篇文献是：Front. Genet., 12 October 2018 | https://doi.org/10.3389/fgene.2018.00469
- 文章标题：Identification of Candidate Biomarkers Correlated With the Pathogenesis and Prognosis of Non-small Cell Lung Cancer via Integrated Bioinformatics Analysis
- 纳入4个数据集：(GSE18842, GSE19804, GSE43458, and GSE62113)
- 使用limma包寻找显著的differentially expressed genes (DEGs)
- 使用RobustRankAggreg (RRA)整合多个数据集的差异分析结果
- GO和KEGG数据库注释差异分析结果
- 使用STRING数据库搜索差异基因集的PPI网络
- 使用Cytoscape, and Molecular Complex Detection (MCODE)寻找PPI网络的hub基因：OP2A, CCNB1, CCNA2, UBE2C, KIF20A, and IL-6
- 使用 Gene Expression Profiling Interactive Analysis (GEPIA) 网页工具检验hub基因是否具有泛癌效应
- 使用网络数据进行 Kaplan Meier-plotter (KM) 分析hub基因是否具有生存预测能力
第二篇文献是：Mol Med Rep. 2018 May; 17(5): 6379–6386.
- 文章标题：Identification of key differentially expressed genes associated with non-small cell lung cancer by bioinformatics analyses
- 纳入4个数据集 : GSE21933, GSE33532, GSE44077 and GSE74706
- 21 tumor samples and 21 normal samples for GSE21933
- 80 tumor samples and 20 normal samples for GSE33532
- 65 tumor samples and 65 normal samples for GSE44077
- 18 tumor samples and 18 normal samples for GSE74706
- 各个数据集分别做差异分析挑选显著的(DEGs) ，阈值都是 (adjust P-value <0.05 and |log2fold-change (FC)|>1)
- 对4个数据集的差异分析结果找重合部分，韦恩图展现
- GO和KEGG数据库注释差异分析结果
- 使用STRING数据库搜索差异基因集的PPI网络
- 使用DEGs with a degree score ≥19 阈值判定hub基因：CCNB1, CCNA2, CEP55, PBK and HMMR
- 使用网络数据进行 Kaplan Meier-plotter (KM) 分析hub基因是否具有生存预测能力
第三篇文献是：Published: 26 October 2018
- 文章标题：Transcriptomic and functional network features of lung squamous cell carcinoma through integrative analysis of GEO and TCGA data
- 纳入7个数据集是：GSE8569, GSE21933, GSE33479, GSE33532, GSE40275, GSE62113, GSE74706
- 对GSE数据集，统一使用limma包，阈值为(|Log2FC| > 2, adjusted p-value < 0.05) 来选择显著差异表达基因
- 把所有7个数据集样本合并使用SVA包的combat函数去除批次效应重新使用limma包选择显著差异表达基因
- 对TCGA数据库的502 tumors and 49 adjacent non-tumor选择差异基因
- 整合GEO和TCGA数据库得到 129 genes (91 up-regulated and 38 down-regulated)
- 与前两个文章同样的下游分析得到hub基因，这次有点多，14个 ：CCNB2, PLK1, KIF2C, CENPA, CENPF, BUB1, BUB1B, BIRC5, CENPE, ZWINT, AURKB, CHEK1, EXO1, RAD51, and RFC4
- 对TCGA数据库的LUSC使用GDCRNAtools选择：a total of 124 DElncRNAs (|Log2FC| > 2, FDR < 0.05) and 74 DEmiRNAs (|Log2FC| > 2, FDR < 0.05) ，构建ceRNA network
- 使用 Cytoscape 展示ceRNA network ，共 25 lncRNAs, 14 miRNAs and 14 mRNAs
学徒作业（二）
做3次甲基化芯片差异分析，首先需要阅读我在生信技能树的甲基化系列教程，目录如下：
- 01-甲基化的一些基础知识.pdf
- 02-甲基化芯片的一般分析流程.pdf
- 03-甲基化芯片数据下载的多种技巧.pdf
- 04-甲基化芯片数据下载如何读入到R里面.pdf
- 05-甲基化芯片数据的一些质控指标.pdf
- 06-甲基化信号值矩阵差异分析哪家强.pdf
- 07-甲基化芯片信号值矩阵差异分析的标准代码.pdf （微信交流群在这里）
- 08-TCGA数据库的各个癌症甲基化芯片数据重新分析.pdf
- 09-TCGA数据库的癌症甲基化芯片数据重分析.pdf
- 10-TCGA数据辅助甲基化区域的功能研究.pdf
- 11-按基因在染色体上的顺序画差异甲基化热图.pdf
- 850K甲基化芯片数据的分析.pdf
- 使用DSS包多种方式检验差异甲基化信号区域.pdf
然后就可以看我在B站免费分享的视频课程《甲基化芯片（450K或者850K）数据处理 》，详见：免费视频课程《甲基化芯片数据分析》
3次甲基化芯片差异分析包括：
- DCIS (n=40) VS adjacent normal (n=15)
- 13 later developed invasive disease VS 27 other DCIS
- 13 later developed invasive disease VS adjacent normal (n=15)
每个甲基化差异比较都需要标准5个图表
甲基化芯片的差异分析的标准图表来源于参考文献《Inflammatory cytokines shape a changing DNA methylome in monocytes mirroring disease activity in rheumatoid arthritis》：
- (D) DNA methylation heatmap of CD15-CD33 CD11b cells isolated from RA and HD peripheral blood. The heatmap includes all CpG- containing probes displaying significant methylation changes (FDR<0.05). A scale is shown at the bottom ranging from −4 (lower DNA methylation levels, blue) to 4 (higher methylation levels, red).
- (E) Representation of selected gene ontology categories obtained from the analysis of differentialy methylated CpG sites comparing HD and RA samples using Genomic Regions Enrichment of Annotations Tool.
- (F) Beta values showing methylation of individual CpGs in both the hypermethylated and the hypomethylated CpG sets. A schematic representation of each gene is depicted. Arrows refer to TSS and transcription direction (in red the analysed CpGs location).
- (G) Analysis of differentially variable positions identified with iEVORA algorithm. Significant DVPs are those with a t-test value <0.01 and an adjusted Bartlett test value <0.01.
- (H) DNA methylation plot of selected genes displaying DNA methylation variability in HD and RA group of samples. Mann-Whitney tests were used to determine significance (*p<0.05, **p<0.01 and ***p<0.001; n.s., not significant). DVP, differentially variable position; FDR, false discovery rate; HD, healthy donor; n.s., not significant; RA, rheumatoid arthritis; TSS, transcriptional start site.
