摘要
因为大多数研究都集中在肿瘤的内在致癌通路上，所以在肿瘤免疫微环境（TIME）中m6A甲基化的潜在作用仍然难以捉摸。在本文中，作者系统地研究了769例头颈部鳞状细胞癌（HNSCC；Cancer Genome Atlas [TCGA]，n = 499；GSE65858，n = 270）中重要的m6A调节因子与PD-L1和免疫浸润的相关性。PD-L1表达显然与m6A调节因子有关。通过15个m6A调节因子的一致性聚类确定了两个分子亚型（cluster1 / 2）。cluster2优先与预后良好，PD-L1表达上调，更高的免疫评分和明显的免疫细胞浸润相关。G2M检查点，mTORC1信号和PI3K / AKT / mTOR信号的标志在簇1中显著富集。使用七个与m6A调节因子相关的信号构建了预后风险评分，这些信号代表HNSCC的独立预后因素。与高风险患者相比，低风患者表现出更高的免疫评分和PD-L1表达上调。一致地，在外部GSE65858队列中，m6A调节因子对免疫调节和存活表现出相同的影响。进一步的分析表明，基于m6A调节因子的特征与TIME有关，并且它们的拷贝数变化会动态影响浸润肿瘤的免疫细胞的数量。本文的研究共同阐明了m6A甲基化在HNSCC中的重要作用。基于m6A调节因子的特征可能充当HNSCC中TIME的关键，代表改善免疫治疗功效的有希望的治疗靶标。
流程图
结果简述
1. HNSCC中m6A RNA甲基化调节因子的表达上调
为了评估m6A调节因子在HNSCC起始和发育中的生物学功能，作者基于TCGA数据，系统研究了HNSCC与相邻正常对之间15个m6A调节基因的表达模式。作者下载了43个与肿瘤相邻的正常对的表达谱数据集，并分析了所选m6A调节因子的不同表达。HNSCC和正常组织中m6A调控基因的表达水平明显差异，如下图所示：
“reader”（即KIAA1429，METAL3，RBM15，WTAP，ZC3H13和METTL16），“writer”（即HNRNPC，YTHDC1，YTHDF1，YTHDF2和YTHDF3）和“eraser”（ALKBH5和FTO）的表达水平在HNSCC组织中显著高于正常邻近组织。HNSCC组织中“reader” YTHDC2的表达水平明显低于正常组织。此外，在正常和HNSCC组织之间，关于“writer” METTL14的表达水平没有统计学上的显著差异。这些结果表明m6A RNA甲基化调节因子在HNSCC的发展中具有重要的生物学作用。
2. HNSCC患者特征和生存率与m6A RNA甲基化调节因子的一致性聚类显著相关
根据m6A调节因子的表达水平和模糊聚类度量的比例所显示的相似性，可以确定k = 2具有最佳的聚类稳定性。根据m6A调节因子的表达水平，总共499例HNSCC患者被分为两个亚型，即cluster1（n = 203）和cluster2（n = 296）（下图A）。在cluster2中，单个m6A甲基化调节因子的表达低于cluster1，尤其是METTL3和HNRNPC的表达水平（下图B）。然后比较了两种亚型之间的临床病理特征（下图B）。cluster2主要包含女性HNSCC，cluster 2优先与低的WHO等级相关。显然，cluster2的免疫评分高于cluster1。cluster2的总体生存期(OS)和无病生存期（DFS）均比cluster1更长（图2C和2D）。
3. PD-L1与m6A RNA甲基化的关联
为了探讨PD-L1与m6A RNA甲基化的关系，作者评估了两种亚型的差异表达以及PD-L1与m6A调节因子的相关性。与正常邻近组织相比，HNSCC组织中PD-L1的表达水平上调（如下图A）。在cluster2中PD-L1的表达水平明显高于在cluster1中的表达水平（下图B）。在TCGA队列中，PD-L1的表达与METTL3，RBM15，WTAP，HNRNPC，YTHDC2和YTHDF3的表达水平显著正相关，而与KIAA1429，YTHDF1和FTO的表达水平则显著负相关（下图C）。此外，在GSE65858队列中获得了一致的结果（下图C）。
4. 与独特的免疫细胞浸润相关的m6A RNA甲基化调节因子的一致性聚类簇
为了研究m6A调节因子对HNSCC免疫微环境的影响，作者评估了m6A调节因子表达上调的cluster1和m6A调节因子表达下调的cluster2之间的免疫分数和免疫浸润水平（下图D）。
这两个簇揭示了免疫评分的显著差异（下图A）。
免疫评分较高的cluster2的预后要大于cluster1的预后。随后，分析了两个亚组之间22种免疫细胞类型的比例。Cluster1显示CD4T细胞，CD4记忆激活的T细胞和嗜酸性粒细胞的浸润水平更高（下图所示）：
而cluster2中B记忆细胞，调节性T细胞（Tregs），NK细胞激活，单核细胞，巨噬细胞M2，树突状细胞激活，嗜中性粒细胞和肥大细胞浸润水平更高（如下图所示）。
进而，作者进行了基因集富集分析（GSEA）。结果表明恶性肿瘤的标志，包括G2M检查点，mTORC1信号传导和PI3K / AKT / mTOR信号传导与cluster1相关（下图G）。因此，PI3K / AKT / mTOR通路可能与cluster1 / 2的不同免疫微环境有关。
5. m6A RNA甲基化调节因子的预后特征的构建和验证
为了准确预测HNSCC患者中m6A调节因子的临床结果，作者基于TCGA训练队列中15种m6A调节因子的表达值，进行了LASSO回归分析。确定了七个m6A调节因子，即METTL3，YTHDC2，METTTL14，RBM15，YTHDC1，ZC3H13和HNRNPC。使用LASSO算法获得的系数计算TCGA训练和验证队列的风险评分，公式如下：（风险评分= 0.1172 METTL14表达水平）（0.0628 METTL3表达水平）（0.1163 YTHDC2表达水平） （0.0245 ZC3H13表达水平）（0.0453 RBM15表达水平）（0.0223 YTHDC1表达水平） （0.0174 HNRNPC表达水平）。随后，根据中位风险评分将患者分为高风险和低风险组。
在下图A和B中显示了TCGA训练和验证队列中基于m6A调节因子的七个特征的风险评分，OS，OS状态和表达谱的分布。热图结果表明，高风险组中包括METTL3，YTHDC2，RBM15和YTHDC1在内的高风险m6A调节因子在高风险组中高表达，而保护性m6A调节因子（包括METTL14，ZC3H13和HNRNPC）的表达水平上调。在TCGA训练和验证队列中，低风险组的OS高于高风险组的OS（如下图C和D）。为了评估七个已识别风险特征的预后准确性，作者通过比较各自的AUC值进行了3年和5年的ROC曲线分析。在TCGA训练队列中，七个风险信号的3年和5年AUC值分别为0.798（95％CI：0.712至0.824）和0.825（95％CI：0.768至0.873）。在TCGA验证队列中，七个风险信号的3年和5年AUC值分别为0.775（95％CI：0.709至0.816）和0.814（95％CI：0.758至0.864）。AUC值表明，七个m6A调节因子的标记物对HNSCC患者的预后具有良好的区分性能。这些结果表明，基于七个风险特征计算的风险评分可以准确预测HNSCC患者的预后。
6. 与HNSCC的等级，免疫分数和放疗相关的预后风险评分
进一步评估了风险评分与临床特征之间的关系。热图证明了TCGA训练队列中高风险和低风险组中七个m6A调节因子的表达水平（下图A）。高风险组中METTL3和YTHDC2的表达水平通常低于低风险组。在低风险组中，HNRNPC和ZC3H13的表达水平较低。高风险组和低风险组之间在聚类亚型（p <0.001），等级（p <0.05）和免疫评分（p <0.001）方面存在显著差异。作者还进一步检查了风险评分与亚型，分类和免疫评分之间的关系。cluster1的风险评分明显高于cluster2（下图B）。风险评分随着组织学等级的提高而增加（下图C）。与低免疫评分组相比，高免疫评分组的风险评分较低（下图D）。这些发现表明，HNSCC患者的风险评分与亚型，等级和免疫评分显著相关。
为了验证在其他HNSCC病例中m6A甲基化调节因子对免疫调节和存活具有相同的影响，我们从GEO中选择了GSE65858数据集作为外部验证队列。与TCGA分析一致，低风险评分患者的OS较长于高风险评分患者（下图A）。通过使用3年和5年时间ROC分析，在GSE65858队列中评估了风险评分的生存预测（下图B）。一致地，低风险评分患者明显有更高的免疫评分（下图C）。此外，作者发现在TCGA训练集，TCGA验证和独立GSE65858队列中，高风险评分患者的PD-L1表达水平低于低风险评分患者（下图D-F）。
作者探讨了放疗的应用是否会影响HNSCC患者OS风险评分的预测性能。发现高风险和低风险组的放疗患者的OS更好（下图A–D），但是高危评分患者比放疗低危患者受益更多。在高风险组中，接受放射治疗的患者比未接受放射治疗的患者具有更好的生存优势（下图A和C）。在低风险组中，放疗的生存获益相对不明显（下图B和D）。因此，高风险评分患者比低风险评分患者更有可能受益于放疗。
7. m6A调节因子特征的遗传改变对免疫细胞浸润的影响
作者分析了六种免疫细胞类型的风险评分与浸润水平之间的关系，以评估七种基于m6A调节因子的标记对HNSCC免疫微环境的影响。风险评分与B细胞，CD4 T和CD8 T细胞（下图A-C）的浸润水平之间存在显著的负相关性。风险评分与中性粒细胞，巨噬细胞和树突状细胞的浸润水平呈正相关（下图D-F）。该结果证实，基于m6A调节因子的风险特征与HNSCC免疫微环境有关。
作者进一步分析了基于m6A调节因子的CNA对免疫细胞浸润的影响，以阐明风险评分与不同免疫细胞浸润相关的潜在机制。所识别的m6A调节因子特征的CNA显著影响HNSCC中B细胞，CD4 T细胞，CD8 T细胞，嗜中性粒细胞，巨噬细胞和树突状细胞的浸润水平（如下图所示）。这些结果表明，m6A调节因子对HNSCC患者的TIME具有关键的调节作用。
总之，本研究系统地评估了HNSCC的预后价值，PD-L1的相关性，在TIME中的作用以及m6A RNA调节因子的潜在调节机制。PD L1上调与m6A甲基化相关。通过对m6A调节因子的一致性聚类确定了两种HNSCC亚型（cluster1 / 2），这些调节因子对HNSCC患者的预后进行了分层，并同时显示了明显不同的TIME。从基于m6A调节因子的七个特征中得出的风险评分是HNSCC患者的独立预后指标。高风险评分的患者可能会从放疗中受益更多。基于m6A调节因子的风险特征与HNSCC患者的免疫细胞浸润水平显著相关。m6A RNA甲基化可能与PI3K / AKT / mTOR信号通路协同参与HNSCC免疫微环境的调节。因此，识别与影响肿瘤免疫反应的分子通路相关的m6A调节因子并进一步研究其调节机制可能为改善肿瘤的治疗提供有希望的目标。
