Genetic and Immune Changes Associated with Disease Progression under the Pressure of Oncolytic Therapy in A Neuroblastoma Outlier Patient
神经母细胞瘤离群患者在溶瘤治疗压力下与疾病进展相关的遗传和免疫变化
一、研究背景
作者团队开发了一种关于癌症的新治疗策略（Celyvir）：通过使用自体骨髓来源的间充质干细胞（MSC）反复静脉内给药，以提供溶瘤腺病毒（ICOVIR-5）[一种经过改造的腺病毒]来治疗晚期癌症患者。
由于对于此项治疗方法的临床经验很少，作者希望通过研究患者的信息获得药物动力学等方面的信息，并了解肿瘤中的病毒复制如何激活抗肿瘤免疫反应及对肿瘤免疫学的影响，包括肿瘤浸润性免疫细胞和肿瘤微环境。
二、研究思路
三、结果解析
1、溶瘤病毒疗法在肿瘤进化过程中浸润性免疫细胞的景观
作者对接受最大溶瘤病毒剂量（70dose）的患者进行了深入表征：
为了确定溶瘤病毒治疗压力下肿瘤演变的生物学特征，使用不同的算法分析了在治疗过程中稳定期和进展期时从肿瘤样品中获得的RNA-Seq数据，作者发现，与疾病进展期相比，稳定期更易被免疫细胞浸润。
- 使用ESTIMATE（使用表达数据，估计恶性肿瘤组织中基质细胞和免疫细胞的含量）评估肿瘤组织中浸润的基质/免疫细胞的存在
- 在疾病的两个阶段，免疫评分（p = 0.0025）和基质评分（p = 0.06，图1A）之间都存在主要差异。
图1A.ESTIMATE 评分结果
- Immunophenoscore（一种衡量肿瘤总体免疫原性的指标）在稳定期评分高于进展期（p = 0.0005，图1B）。
图1B.Immunophenoscore 评分结果
- MCPcounter软件获得有关特定细胞谱系渗透的信息（图1C）
- B淋巴细胞（得分3.5 vs.0.5; p = 0.0000003）， T淋巴细胞（得分2.2 vs. 1.8; p = 0,0007），CD8 阳性T细胞（得分3 vs. 2.8; p = 0.0313），NK淋巴细胞 （得分0.6 vs. 0.55; p = 0.0241），髓样树突状细胞（得分1.8 vs 1.1; p = 0,0002）
- 相比之下，与稳定期相比，单核细胞在进展期中的数量明显更多（得分3.2 vs. 2.9；p = 0,0005）
- 与稳定期相比，进展期内皮细胞和成纤维细胞的分数较低
图1C.MCPcounter结果，显示两个肿瘤样本存在大量不同的免疫亚群
- 免疫种群的估计使用QuanTIseq算法进行（补充图S1）
- 与进展期相比，稳定期存在更多的B细胞（p = 0.011），树突状细胞（p = 0.024），NK细胞（p = 0.026）和T淋巴细胞（p <0.05）
- 在稳定期中M2巨噬细胞的丰度显着更高（p = 0.023），Treg的丰度也有更高的趋势（p = 0.069）这与发炎少和肿瘤前期的肿瘤微环境经典相关。
补充图1.QuanTiSeq预测的两个疾病阶段的免疫表型
- 通过CIBERSORT估算每个样品中22种免疫细胞亚型的相对丰度（图1D）
- B淋巴细胞（幼稚B细胞和记忆B细胞）为疾病稳定期中的主要细胞群。同时M2巨噬细胞是髓样细胞中的主要亚群
- 在疾病进展期，浆细胞似乎是B淋巴细胞的主要成分，而CD8在肿瘤浸润性T淋巴细胞（TIL）中占主导地位。活化的NK淋巴细胞在此时也表现出更多的代表性，而M2巨噬细胞在髓样细胞群中占主导地位，并且随着M0和M1巨噬细胞的的总比例增加。
图1D.CIBERSORT分析结果，显示不同的免疫细胞亚群的比例
总而言之，所有分析的结果表明，在疾病的稳定期，适应性免疫细胞的较高的浸润和活性主导着免疫格局，肿瘤进展期时，免疫浸润细胞群更明显地趋向于先天免疫细胞的存在。
此外，作者在数据集中研究了肿瘤进化过程中的趋化因子表达谱变化。发现该变化可能与已经描述的免疫细胞浸润中发现的差异有关。（图二）
- 在稳定期：
- 与B淋巴细胞趋化性相关的基因（CCL [C-C配体] 19，CCL21，CXCL [C-X-C]配体] 12和CXCL13）的基因表达明显更高。
- 已知的淋巴细胞（CCL19，CCL20，CCL21和CCL22）和DC（CXCL12）趋化因子在疾病稳定期也以明显更高的水平表达
- 在进展期：
- 募集骨髓细胞（CCL3，CCL4，CCL5），Treg（CCL4）和活化T的趋化因子。淋巴细胞（CXCL9，CXCL10和CXCL11）以明显更高的水平表达
图2.热图显示在疾病的不同阶段，不同组趋化因子的相关性和丰度
2、肿瘤进化过程中的肿瘤浸润性的T淋巴细胞相关分析
作者对肿瘤浸润性T淋巴细胞进行了分析，T细胞受体（TCR）β链基因分析的深度测序表明：
- 在进展期中，来自肿瘤样本的克隆重排数量更高（图3A）
图3A.疾病的两个阶段的T细胞受体（TCR）克隆重排
- 进展期间，与序列库相关的10个最丰富的重排的相对频率也较高（补充表S1）
- 这表明在疾病发展过程中，TIL的浸润更加多样化，在进展时占主导地位的克隆较少。
附表1.每个肿瘤样品的十种最常见的重排
- 稳定期发现的10个最丰富的重排中在进展期仍可以被观察到。
图3B.重排保存情况
随后，作者分析了与T淋巴细胞激活相关的基因的表达水平。结果显示：
- T淋巴细胞在进展期：
- 表达较高水平的颗粒酶（GZMA，GZMB）和穿孔素（PRF1）基因（图4A），以及与慢性激活相关的标志物（HAVCR2，LAG3和TIGIT）（图4B）
图4AB.细胞毒性T细胞活性及免疫监视相关分子
通过定量PCR检测与细胞衰竭相关的T细胞受体（HAVCR2 / TIM3，LAG3和PD1）以及它们中两个最常见的配体（HMGB1和CEACAM，HLA-DR和LSECTIN ， PDL1和PDL2），以及TGFβ的三个已知同工型（TGFB1，TGFB2和TGFB3）发现
- 与稳定期相比，进展期的微环境显示PD1受体的配体（PDL1和PDL2）的表达水平明显更高。LAG3受体在进展过程中也明显过表达，但其两个配体（HLA-DR和LSECTIN）被显着下调（图4C）
附图3.T细胞衰竭和免疫监视相关的分子
此外，作者使用GSVA（基因组变异分析）分析了疾病期间激活的遗传和分子程序。研究发现
- 在稳定期，半胱天冬酶/凋亡途径和细胞周期活化较高（补充图S2）
附图2.与两个疾病阶段的细胞凋亡和细胞周期有关的基因组和分子途径及过程。
3、肿瘤进化过程中的突变和新表位景观
作者根据全外显子测序数据，对肿瘤样品序列变异进行分析，作者发现:
- 进展期发现的序列变异总数高于稳定期检测到的序列变异总数，分别为169个和101个。
- 总体而言，两个样品共有55个单核苷酸变异 作者使用了CONDEL软件鉴定具有假定功能影响的遗传突变，表1列出了仅在肿瘤进展期出现的突变。
表1.CONDEL预测的进展阶段突变列表 作者对全外显子测序数据中对癌症体细胞突变目录（COSMIC）突变特征进行了分析。结果显示，不同样品中的遗传特征存在差异。（图5B，表2）
表2.定量DNA碱基后，在两个肿瘤样品中检测到的突变signature
图5B.两种肿瘤样品中与不同类型癌症相关的不同突变signature情况
- 与进展期相比，稳定期的signature变异更大。但进展期的相对signature丰度更大
- 结果中的signature18与神经母细胞瘤经典相关，并在疾病进展期出现；
- signature2在稳定期出现，与多种癌症相关，并且与激活AID / APOBEC脱氨酶相关。
图5C.两个肿瘤样品中每个碱基对的丰度
随后作者对每个肿瘤样本检测到的HLA单核苷酸变异体（SNV）的存在进行研究，预测新表位，分析结果表明。
- 与稳定期相比，进展期中肿瘤中新表位候选物的负载更高，分别为18和5。
- 疾病稳定期中发现的所有5个候选物也在进展期被检测到。
表3.疾病两个阶段的新表位详细预测及稳定期表位预测
表4.进展期表位预测
在确定了候选表位后，作者对抗原加工及呈递相关基因的完整性进行了研究。
- RNA-seq分析表明抗原加工和呈递的相关表达没有缺陷，与稳定期相比，大部分相关基因在进展期中有更高的表达（图6）
- 新表位可以在肿瘤进化过程中的任意阶段在HLA分子中表达
图6.包含HLA抗原在内的抗原加工呈递相关基因在不同疾病时期表达
小结
在这篇文章中，作者通过对施加了新疗法后单例肿瘤患者的稳定期及进展期两组样本进行研究，通过RNA测序，全外显子测序以及TCR测序来获得肿瘤在不同时期的免疫相关信息：作者首先使用多种算法对RNA测序数据进行了免疫指标相关评分，揭示了各阶段中免疫细胞种群组成及丰度，并研究了肿瘤进化过程中趋化因子表达的差异；随后，作者使用TCR测序对肿瘤浸润的T细胞突变进行分析，对该病例中TCR受体的基因重排进行深入研究。通过定量PCR对与T细胞衰竭相关的T细胞受体及配体进行检测，探究在T细胞衰竭对肿瘤进展的作用。GSVA指示疾病过程中T细胞凋亡以及细胞周期基因的活化表达；作者最后通过全外显子测序对肿瘤样品中的序列变异进行了分析，并使用CONDEL软件鉴定具有假定功能影响的遗传突变，针对COSMIC的突变特征进行了分析，根据HLA中检测出的SNV进行新表位预测。
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