大家好, 今天和大家分享的是 2020 年 4 月发表在Biomed Pharmacother(IF:3.743)上的一篇文章，“Study on the anti-tumor mechanism related to immune microenvironment of Bombyx Batryticatus on viral and non-viral infections of hepatocellular carcinoma”。作者通过网络药理学结合生物信息学方法，分析了传统中药——家蚕对于肝癌的药理机制。
Study on the anti-tumor mechanism related to immune microenvironment of Bombyx Batryticatus on viral and non-viral infections of hepatocellular carcinoma
家蚕免疫微环境对病毒和非病毒感染的肝细胞癌的抗肿瘤机制研究
一、研究背景
肝细胞癌（HCC）是原发性肝癌的主要形式。肝癌的发生和发展主要是病毒的感染（如HBV或HCV），以及其他肝硬化的病因（包括非酒精性脂肪性肝病（NAFLD），酒精相关性肝病和遗传性血色素沉着症）。
HCC是一种免疫原性肿瘤，由潜在慢性肝脏疾病而出现在慢性发炎的肝脏中。这种炎症导致肿瘤发展，并与更高的肿瘤免疫原性有关。HCC包括病毒感染和非病毒性环境，这两类HCC执行不同的基因表达和途径。
作为一种辅助和替代药物，中药（TCM）疗法已广泛用于治疗各种形式的癌症。家蚕（Bombyx batryticatus（B. batryticatus））是中，韩，日医学体系中常见的动物药物。家蚕许多抗肿瘤研究已经证明了其对人类癌细胞系（例如子宫颈癌，肝癌和胃癌）的抗增殖作用。但是家蚕关于肝癌的机制仍不清楚。本文建立了网络药理学整合的TME策略，以揭示家蚕对肝癌的药理机制。
二、分析流程
三、结果解读
1、过滤：活性化合物成分的过滤、DEG和目标靶点的过滤
通过ADME标准（吸收，分布，代谢和排泄）后，共从家蚕中选出6种活性化合物。（檞皮素、山奈酚、β-谷甾醇、胡萝卜甾醇、金色酰胺醇酯、右旋杜仲树脂粉）
- 6种蛋白质与被相应的化合物靶向（化合物节点和蛋白质节点连接在一起）（如图A）
- 从靶向化合物参与的生物学过程可知（图B），这些靶标的生物学过程包括乙型肝炎，前列腺癌，胰腺癌，丙型肝炎，肝细胞癌等。
图1. 活性化合物的过滤
筛选出HCC中重要的DEG，共1,404个基因。在这些DEG中，有1,007个上调，有397个下调。
- A.火山图代表DEG，可从图形和标注看出上调以及下调的基因。
- B. HCC和HTA之间的DEG热图。
- C.过滤出24个靶标和2种化合物的子网。
图2. DEG和核心子网过滤
2、靶点与KEGG富集的蛋白质的相互作用
STRING数据库分析核心24个靶标的潜在的蛋白质-蛋白质相互作用网络。KEGG富集的结果表明，最主要的5个途径是乙型肝炎，肝细胞癌，化学致癌作用，类固醇激素的生物合成和p53信号途径。作者选择6个靶点及其邻域（仅化合物）作为核心子网络，将其分为5个模块：乙型肝炎、肝癌、化学致癌、类固醇激素生物合成和p53信号通路。家蚕中的化合物具有多靶点效应，可能参与多种与肝癌相关的途径。
- A.核心24个基因的蛋白质-蛋白质相互作用网络。
- B. KEGG的DEG富集。
图3. 核心24个靶标与KEGG富集的蛋白相互作用
3、分析肝癌中的适应性免疫细胞
- 热图显示了22种免疫细胞亚型分别在VIR组和NVIR组的计数和激活状态。（A：NVIR组；B：VIR组）
- 生存曲线：NVIR组的预后要优于VIR组。
- 小提琴图：NVIR组合和VIR组的4个TMES（浆细胞，肥大细胞活性，巨噬细胞（M1）和γδT细胞）显著不同。（p<0.05)
图4. HCC的肿瘤微环境
4、测试VIR组和NVIR组靶标基因的预后
作者采用了多变量Cox回归分析基因的预后。其中3个基因是VIR组的独立因子，是高危因素（HR>1）。NVIR组14个基因与预后密切相关，14个基因与存活率显著相关。
表1 VIR和NVIR的靶标基因的预后分析
5、分析TME（VIR组合NVIR组）与靶标基因之间的相关性
- VIR组：AKR1C3与VIR中的巨噬细胞M1呈显着负相关（cor = –0.35，p<0.001）；而在NVIR组中，AKR1C3和巨噬细胞M1之间的相关性非常低（cor = 0.064，p= 0.36）。
- AKR1C3的生存曲线：高水平的AKR1C3在VIR组中预后较差（HR = 2.32，p= 0.012）。在NVIR组中无统计学意义（p> 0.05）。
图5. 预后目标基因AKR1C3的分析
- VIR组：NR1I2，CYP1A2和CYP3A4与VIR中的巨噬细胞M1相关性不大。它们均与巨噬细胞M1无关，高水平的靶标和患者的预后无关（p>0.05)。
图6. VIR组中的预后目标分析
- NVIR组：分析NVIR组中的这三个靶标。它们均与巨噬细胞M1显著相关，高水平靶标NR1I2和CYP3A4对患者的预后要好于低水平(p<0.05)。
图7. NVIR组中的预后目标分析
6、模拟分子对接
- 结合位点：绿色，青色，红色，蓝色圆圈代表疏水性，极性，带负电荷，带正电荷的残基。
- 山奈酚与靶标结合方式的三维表征：结合部位的残基以绿色棒状物显示，山奈酚以黄色棒状物显示。
- 在VIR组，AKR1C3与预后和巨噬细胞M1有关。下图模拟了山奈酚与AKR1C3蛋白的相互作用，结果表明山奈酚可以很好地结合AKR1C3蛋白。
图8. VIR组，AKR1C3与山奈酚的对接结果
- 山奈酚与靶标分子的结合位点。绿色，青色，红色，蓝色圆圈代表疏水性，极性，带负电荷，带正电荷的残基。
- 山奈酚与靶标分子结合方式的三维表征。结合部位的残基以绿色棒状物显示，山奈酚以黄色棒状物显示。
- 在NVIR组，NR1l2、CYP1A2、CYP3A4与预后和巨噬细胞M1有关。下图模拟了山奈酚与三种蛋白的相互作用，结果表明山奈酚可以较好结合这三种蛋白，对CYP1A2的包被作用最好。
图9. NVIR组，NR1l2、CYP1A2、CYP3A4与山奈酚的对接结果
- 槲皮素周围残基的电性槲皮素及其与靶分子的相互作用。绿色，青色，红色，蓝色圆圈代表疏水性，极性，带负电荷，带正电荷的残基。
- 槲皮素与靶标分子结合方式的三维表征。结合部位的残基以绿色棒状物显示，槲皮素以黄色棒状物显示。
- 在NVIR组，NR1l2、CYP1A2、CYP3A4与预后和巨噬细胞M1有关。下图模拟了槲皮素与三种蛋白的相互作用，结果表明槲皮素可以较好地结合这三种蛋白，其中与CYP1A2的结合最理想，与NR1l2的结合效果一般。
图10. NVIR组，NVIR组，NR1l2、CYP1A2、CYP3A4与槲皮素的对接结果
小结
作者过滤出家蚕的活性成分，以及过滤出HCC中差异表达的基因，得到活性成分的靶标与DEG的重叠部分，筛选出重叠靶标。随后作者测试了VIR和NVIR中的靶标，表征和量化了HCC免疫细胞亚型。作者分组分析靶标与免疫微环境的相互作用，分析了它们对于患者的预后。结果表明：VIR组中靶蛋白AKR1C3与M1巨噬细胞呈显着负相关，而NVIR组中相关性很弱，高水平的AKR1C3在VIR组中预后较差；在NVIR组中，NR1I2，CYP1A2和CYP3A4与巨噬细胞M1密切相关，而在VIR组相关性弱，高水平NR1I2和CYP3A4的预后较好。以上结果反映出家蚕的抗癌作用可能与免疫微环境密切相关。分子对接结果表明，槲皮素和山奈酚可以通过调节TME中的M1细胞发挥抗肿瘤作用。
局限性：本研究仅研究了家蚕单一疗法的抗肝癌机制。将来，有必要进一步研究家蚕与其他中药或西药结合的作用机理。此外，本文忽略了家蚕的安全性，未确定家蚕的毒性成分。
