一般情况下，研究目标是蛋白，单是蛋白的调节，就涉及非常多的生化过程，基因组甲基化、转录及其调控（如目前热点lncRNA、miRNA和cirRNA）、翻译和翻译后修饰（最常见的是磷酸化/去磷酸化、泛素化）。
而在疾病过程中，上述任一环节的改变都会通过级联放大反应导致最功能执行者——蛋白水平的变化，蛋白变化是结果，而这个结果的原因既可以是蛋白自身调控的变化，也可能是基因组或转录水平的变化导致的。
因此，检测基因表达差异时，起码要检测兴趣基因的mRNA和protein，所以要用到RT-PCR和Western blot。
正如我们在生信分析的总结中所说，差异表达是研究的起点，也是研究的难点。虽然万事开头难，但是千里之行始于足下，检测差异表达是第一步。下面我们结合文献，一起感受下，如何检测差异表达。
检测差异表达分为入门（细胞）、进阶（动物）和高阶（测序）三个段位。
入门级别
差异表达的检测一般是放在文章的Figure1，入门级别是从细胞水平入手的。检测方法包括qRT-PCR、Western blot、免疫组化（包括免疫荧光），生信分析可辅助证明。
文章来自TMEM9 promotes intestinal tumorigenesis through vacuolar-ATPase-activated Wnt/β-catenin signalling (Figure1)。该图证明TMEM9在结肠癌中高表达，图b是oncomine数据的总结，显示TMEM9在乳腺癌、宫颈癌、结肠癌和粘液瘤中高表达 (in silicon)；图c通过qRT-PCR和Western blot证明TMEM9在结肠癌细胞系中高表达 (in vitro)；图d是在小鼠结肠癌肿瘤组织(in vivo)进一步证明。
图e是通过免疫组化在结肠癌患者标本中检测TMEM9的高表达 (clinical specimen)。
生信、细胞、动物和临床样本四个角度，从转录和翻译水平证明TMEM9在结肠癌中高表达，思路明确，方法多样，值得学习！
文章来自FGL2 promotes tumor progression in the CNS by suppressing CD103 dendritic cell differentiation (Figure1)。图a和b用Western blot检测胶质瘤细胞系、PBMC中FGL2的表达。
图c用流式细胞术检测新诊断胶质瘤患者肿瘤中FGL2的表达。
图d用免疫组化检测新诊断胶质瘤患者肿瘤中FGL2的表达。
该论文更侧重临床标本的检测，是从Western blot、流式细胞术和免疫组化的方法学角度对差异表达进行检测。逻辑清晰，也是很好的套路。
进阶级别
进阶级别是从动物模型入手的。检测方法也是qRT-PCR、Western blot、免疫组化（包括免疫荧光），生信分析可辅助证明。
文章来自TOX promotes the exhaustion of antitumor CD8 T cells by preventing PD1 degradation in hepatocellular carcinoma。图A是流式细胞术检测肿瘤浸润淋巴细胞中PD-1、TIM3等maker的表达。
图B是肿瘤浸润淋巴组织的单细胞测序结果，属于高阶。图C是对临床标本的肿瘤浸润淋巴细胞做进一步流式检测，分析CD8 T细胞不同耗竭状态的比例。
图D是肝癌小鼠模型中肿瘤浸润淋巴细胞耗竭状态的检测，方法是流式细胞术。
图E是另一种肝癌模型，自发诱导性肝癌模型。肿瘤浸润淋巴细胞耗竭状态的检测，方法仍然是流式细胞术。
补充图Figure1中图A和图B是生信分析结果。图A是韦恩图对多个数据库的检测结果取交集；图B是对耗竭性CD8 T细胞中的TOX进行对比分析，箱型图。
本文流式分析是主要方法，既没有qRT-PCR，也没有Western blot；标本类型主要是临床标本和动物肿瘤组织。从临床标本到动物模型的思路，逐步递进。
高阶级别
高阶级别是从方法学上讲的，也就是进行测序。特点就是贵！
该图来自TOX reinforces the phenotype and longevity of exhausted T cells in chronic viral infection。图A是小鼠肿瘤组织进行流式检测；图B是测序分析, Tox locus-specific bisulfite sequencing of P14 T cells from mice infected with Armstrong, gp33-low or wild-type clone 13 for 8 weeks；图C是临床标本进行流式检测。
该图来自TOX transcriptionally and epigenetically programs CD8 T cell exhaustion。图a和图b是多维分析和GO分析不同组别中差异表达的基因。
图c是热图展示差异表达的基因，图d是热图展示染色质调控相关的基因，图e是对图d的可视化视图展示；图f显示RNA质谱分析的结果。
高阶差异表达的好处是个性化、数据多，但是不足也很明显，死贵死贵的！！
方法重要，但不是最重要的，小米加步枪干得过飞机加坦克。神器神不神，关键要看人。qRT-PCR和western blot的结果一样可以出现在CNS期刊的论文中，水刊中也有测序的结果。
