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单细胞转录组分析综述
单细胞入门-读一篇scRNA-seq综述
文章信息
今天带来的这篇文章2019年10月刊登在Cell上，题为：Generation of Blastocyst-like Structures from Mouse Embryonic and Adult Cell Cultures。
总览
从胚胎到8细胞阶段的单个小鼠卵裂球可以产生整个囊胚。实验室培养的细胞是否保留相似的生成能力尚不清楚。从单一的干细胞类型开始，扩展到多能干（EPS）细胞，作者建立了3D分化系统，该系统能够通过谱系分离和自组织生成囊胚样结构（(EPS-blastoids（EPS-类囊胚））。EPS-类囊胚的形态和细胞谱系分配类似于胚囊，并且在植入前和植入后早期发育过程中涵盖了关键的形态发生情况。转移后，一些EPS类囊胚进行了植入，蜕膜化，并在子宫内产生了活的组织。单细胞和大量RNA测序分析显示EPS类囊胚包含所有三个囊胚细胞谱系，并且与天然囊胚有转录信息的相似性。作者还证明了，可以通过细胞重编程从成体细胞生成EPS胚囊。因此，这为研究为早期胚胎发生提供了支持。
单细胞测序技术
10X Genomics ：Chromium Single Cell 30 Reagent Kits v3 (10X Genomics, PN-1000092) /Chromium i7 Multiplex Kit (10X Genomics, PN-120262)
分析细胞数量
小鼠类胚囊(3528个细胞)及自然受精的胚囊（288个细胞）
主要结果
用3D分化系统从EPS细胞生成胚泡样结构
单个EPS细胞对所有三个胚泡谱系都有贡献的能力表明，在某些条件下，EPS细胞可以分化并自组织成胚泡状结构，基于此，作者将解离的小鼠EPS细胞接种到微孔中（每微孔5个细胞）以形成小的聚集体。通过建立不同条件的培养基和小分子处理条件，获得了与小鼠胚胎E3.5自然受精胚囊相似的类胚囊结构。
转录组分析结果
作者分析了来自单个EPS类胚囊、blastocyst和morula的bulk RNA-seq结果，并且与其他已发表数据中E3.5 blastocysts和E3.0 morulae结果进行比较，主成分分析显示，EPS类胚囊比morulae更加接近blastocysts（图A）。为了深入了解EPS囊胚和囊胚之间每个谱系之间的相似性和差异，作者进行了单细胞RNA测序，并对从EPS囊胚和囊胚收集的2700多个单细胞的转录组进行了分析。使用SEURAT进行的综合分析表明，来自EPS胚泡和胚泡的细胞在很大程度上彼此重叠（图B）。聚类后共分为7个细胞亚群，其中4个亚群由类囊胚和自然受精囊胚都具有（图C）。
作者进行了无监督的聚类分析，并确认了来自两个样品的相似谱系的聚类（图D）。总体而言，结果证实EPS胚泡包含所有三个胚泡细胞谱系。
为了揭示EPS胚囊和囊胚之间每个谱系之间的差异，作者进行了差异基因（DEG）的功能注释。为两个样品之间的ICM（inner cell mass）及EPI（epiblast）谱系鉴定了53个DEG（图E），结果显示与干细胞维持，繁殖和DNA甲基化相关的功能有关（图H）。类胚囊中， 两个多能性转录因子Sox2和Klf2的表达水平较低（分别降低了28％和43％），而两个DNA甲基化相关的酶基因Tet1和Dnmt3L的EPS降低了18％（图E）。对于PE（primitive endoderm ）谱系，在EPS囊胚和囊胚之间鉴定到67个DEG，其中大多数与囊泡运输和内吞作用有关（图F和I）。对于TE（trophectoderm ）谱系，只有两个DEG（Gjb2和Arhgel6）被确定为两个样本之间存在显着差异（图G）
总结
作者证明了EPS细胞可以单独分化并自我组织，以生成与自然胚泡相同的多个细胞、分子和功能特征的胚泡样结构。类囊胚包含受精囊胚中具备的三种原始细胞类型，单细胞转录组测序分析显示类囊胚与受精囊胚有相似的基因表达特征。该结果为研究早期植入前的发育提供了独特且高度可塑性的体外系统，并且通过进一步优化，可以潜在地利用其在体外生成功能齐全的合成胚胎，为器官移植研究提供依据。
