Cell Reports | 靶向单细胞多组学方法，可在低深度下同时检测蛋白表达和低丰度转录组

2020-08-05 09:56:22 浏览数 (1)

Fred Hutchinson 肿瘤研究中心在4月7日的CELL REPORTS 杂志在线发表最新文章。

文章亮点

  • 多组学：靶向转录组（Target mRNA 492个基因) AbSeq 抗体 (41个表面蛋白)
  • 高通量：27,258个细胞（有效数据）
  • 高效：多样本检测（Single-Cell Multiplexing Kit，SMK）
  • 低成本：靶向转录组测序2,000-4,000 reads/cell，仅为全转录组方法所需测序深度的十分之一
  • 高灵敏度：检测低丰度转录本

单细胞多组学实验方案

  1. 来自三个健康供体的PBMCs（外周血单核细胞），经过样本预处理后，获得单细胞样本（CD45 live PBMCs 和 EBV-tetramer CD8 T细胞）。
  2. 使用BD单细胞多样本检测试剂盒对三个样本进行样本标记后混合。
  3. 使用BD AbSeq抗体（图B的41种AbSeq抗体）对混合后的样本进行蛋白标记。
  4. 将所有样品加入BD Rhapsody™ Cartridge（微孔板），使用磁珠捕获单细胞。裂解单细胞后，对靶向mRNA、AbSeq蛋白、多样本标签进行cDNA建库及测序。
  5. 对测序结果进行质控，得到27,258个细胞的数据进行后续分析。

实验结果

1. AbSeq抗体方法VS.流式细胞方法

对比多组学蛋白检测和流式方法（27,000个细胞的流式数据），可以观察到所有的免疫细胞类型群体在两种方法中的出现频率相当。

图C.单细胞多组学方法和流式细胞方法的比较。

2. 靶向转录组(Target mRNA)方法 VS. 全转录组学方法(WTA)

(1) 与 WTA 相比，Target mRNA方法同样可以很好的鉴别PBMCs中的各免疫细胞亚群,在单细胞水平上真实的反应细胞间的异质性。

上图.使用BD Target mRNA多组学方法鉴别外周血中主要免疫细胞亚群。

上图. 表达差异最大的部分基因，在Target mRNA、WTA、WTA reference dataset中的表达情况。

(2) 不同read depths对Target mRNA方法中蛋白和转录组的分辨率影响

对一个供体的样本分别在不同的read depth下进行对比，如下图所示：

上图.不同read depths对Target mRNA转录组和AbSeq数据分辨率的影响 a. ~27000 reads/cell ( 抗体文库: 18000 reads/cell；转录本文库: 9000 reads/cell) 设置为100% read depth; b. 抗体文库: 4000 reads/cell；转录本文库: 2000 reads/cell）为20% read depth; c. 10% read depth以此类推。

由上图可得出结论：从细胞聚类图和最大表达差异基因来看，100%和20% read depth对结果无明显差别。综合考虑，建议Target mRNA方法中，转录本文库：2,000-4,000 reads/cell (约为WTA方法中的十分之一)，抗体文库：200-400 reads/抗体/cell。

3. 单细胞Target mRNA AbSeq对T细胞进行分析

多组学分析不仅能够鉴别典型memory T细胞群，同时也可对罕见的抗原特异性CD8 T细胞进行研究。

  • 对T细胞亚群的转录组学和蛋白质表达进行联合分析，才能真实的研究T细胞生物机制。（上图C）
  • 结合蛋白表达和mRNA表达分析，可以观察到5个经典的naïve和memory T细胞亚群。（图DEF）
  • 该方法可以从所有CD8 T细胞中鉴别出EBV-specific CD8 T细胞亚群，该亚群的两个特征性差异化表达基因为：Granulysin基因表达下调，YBX3基因表达上调。（图H）

4. 单细胞Target mRNA AbSeq用于细胞因子、趋化因子等相关分析。

短期刺激T细胞和NK细胞显示出趋化因子的异质性，并与早期活化标记物CD69脱节。用佛波肉豆蔻酸酯（PMA）和离子霉素刺激纯化的T细胞和NK细胞1小时。使用涉及259个基因的以T细胞为中心的转录组学方法探讨了早期的转录变化。

  • 编码CD69、IFNG、FASL和ICOS的转录本在受刺激样本中显著上调。（下图A）
  • CD8 T细胞中，IFNG和TNF基因在CD69转录本阳性细胞和CD69蛋白阴性细胞中表达，而FOSB基因与CDD69蛋白共表达。（下图B）
  • CD8蛋白 T细胞聚类图显示5个亚群，结合CD45RO和CD45RA表达，可判别出naïve、effector、memory T细胞（下图C）。热图显示这5个细胞亚群内关键效应转录本的表达（下图D）。

5. 单细胞Target mRNA AbSeq在其他免疫细胞类型中的应用

上图为PBMCs髓系免疫细胞的多组学分析

总结

与WTA相比，单细胞Target mRNA AbSeq抗体可以准确识别并分析外周血细胞中的各免疫细胞亚群，并且只需要WTA方法约十分之一的测序读取深度，就可以对一些低丰度的细胞亚群进行高灵敏度的分析，是一种低成本高效率的方法。

单细胞多组学，蛋白质结合转录组进行分析，深入探索并研究细胞特性，助力人类疾病免疫相关研究。

cell memory na target

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