单细胞技术应用
生殖健康篇
精子发育
精子的生成在时间和空间上有着复杂而有序的过程。现代社会男性生殖障碍的比例越来越高，而不育症的男性患上睾丸癌和前列腺癌的风险比正常男性更高[Guo J et al. Cell Stem Cell. 2017]。
1）对精子进行单细胞测序，有助于了解精子成熟过程中基因重组的特征。Lu S 等人使用多次退火 循环扩增技术(MALBAC[Hou Y et al. Cell. 2013])，对精子进行单细胞全基因组 DNA（scDNA-seq）测 序，首次实现了高覆盖度的单精子的全基因组测序[Lu S et al. Science. 2012]。Hinch AG 等人对小 鼠精子进行 scDNA-seq，绘制了精子的高分辨率交叉图谱和重组阶段的特异性分子特征[Hinch AG et al. Science. 2019]。
2）从单细胞水平上重建精子发育过程中细胞分化的转录和表达顺序，对破译男性相关的生殖障碍 有着重要的意义。Guo J 等人利用 scRNA-seq 的方法，首次从单细胞层面上描绘了精子干细胞在正常发 育过程中所经历的多阶段过程，同时从基因角度诠释了男性不育症的原因[Guo J et al. Cell Stem Cell. 2017]。此外，Wang M 等人对正常成年男性和梗阻性无精症患者的睾丸组织进行了 scRNA-seq， 从单细胞角度阐明了人类精子发生过程中的基因表达调控网络和细胞转变（cell fate transition） 的路径，为无精症的分子诊断和临床治疗提供了全新的视角[Wang M et al. Cell Stem Cell. 2018]。
图 2-1 基于 MALBAC 扩增进行单细胞全基因组 DNA 测序的基本流程
[Hou Y et al. Cell. 2013]
3）对精子进行单细胞测序也有助于探索疾病机制。一项研究显示，对有正常后代及自闭症后代的 人类男性精子进行单细胞 DNA 和 RNA 测序，从单细胞水平鉴定精子是否发生自闭症相关的基因变异及基因表达差异[Tomoiaga D et al. NPJ Genom Med. 2020] ，发现精子中确实存在遗传变异。这可 用于分析单个精子细胞转录组的基因表达和突变动力学，为疾病机制提供更深层次的见解。
卵子发育
卵子是人体最大的细胞，在单细胞研究中有着天然的优势。卵细胞的单细胞测序可用于研究卵子发育过程及卵巢疾病对卵子发育的影响。
1）从单细胞水平上研究卵细胞成熟的原理。Zhao H 等人通过对体外成熟和体内成熟的卵细胞进行 scRNA-seq 发现[Zhao H et al. Antioxid Redox Signal 2019]，代谢通路的改变是体内外成熟卵母 细胞的最典型差异，代谢通路关键分子 ACAT/HADHA-DPYD 有助于维持卵母细胞发育潜能。
2）单细胞测序可以探索激素导致的排卵异常。小鼠卵母细胞的 scRNA-seq 数据发现[Wang H et al. Nat Commun. 2019]，组蛋白去乙酰化酶可以促进体外卵母细胞的成熟，为解析女性不孕提供新的方向。3）单细胞测序可用于探索卵巢相关疾病对卵细胞发育的影响。对卵巢子宫内膜异位症病人的卵细 胞和健康人卵细胞进行 scRNA-seq[Ferrero H et al. Hum Reprod. 2019]，发现差异表达的一些基因与卵细胞的低质量有关，证实了卵巢疾病与女性不孕的相关性。
4）单细胞测序研究卵巢衰老机制。2020 年 3 月，北京大学汤富酬教授课题组与合作者利用高 精度单细胞转录组测序技术[Si Wang et al. Cell, 2020]，首次绘制了食蟹猴卵巢的单细胞衰老图谱; 同时利用人类卵巢细胞研究体系，发现增龄伴随的抗氧化能力的下降是灵长类卵巢衰老的主要特征之 一。该项研究在单细胞分辨率下更为精确地揭示灵长类动物卵巢衰老的机制之一，确定了人类及其他 灵长类动物卵巢衰老的生物标志物，为开发延缓卵巢衰老及相关疾病的干预策略奠定了理论基础。
胚胎早期发育
人类胚胎在前两个月是最容易流产的时期。对胚胎细胞的单细胞测序，有助于探索胚胎的发育机制和影响胚胎发育的因素，为保障胚胎正常发育提供理论支持。
1）单细胞测序探索胚胎早期发育机制。汤富酬实验室和北医三院乔杰实验室合作通过对人类体外 培养受精卵进行单细胞 DNA 或 RNA 测序[Zhou F et al. Nature. 2019]，发现一些细胞在植入后会更 快地发生甲基化。小鼠、斑马鱼和青蛙早期胚胎的单细胞研究深刻地展示了胚胎发育中一些关键性过 程（表 2-4）。
表 2-4 部分胚胎发育领域的单细胞研究
2）评估环境因素对胚胎发育的影响。对有无尼古丁下人类胚胎干细胞衍生的胚状体进行 scRNA-seq 发现[Guo H et al. Stem Cell Reports 2019]，尼古丁诱导胚状体细胞系发生特异性反应和细胞间通 讯失调，提示尼古丁对胚胎干细胞分化有直接的不良影响，为评价药物和环境毒性对人胚胎发育的影 响提供了一种新的方法。
辅助生殖
单细胞技术有助提高试管婴儿成功率。试管婴儿是重要的辅助生殖手段，目前已经发展到第四代，总体活胎分娩率在 40%左右，不同试管婴儿技术所对应的适应症和成功率均不相同，第三代以前整体成 功率仅约为 35%。从第三代开始，加入了胚胎植入前的遗传学诊断，使整体成功率大幅提高（约 80%）。 目前，胚胎植入前遗传学筛查（PGS）和胚胎植入前遗传诊断（PGD）主要使用的技术有两种，都与单细 胞技术相关：MALBAC（以及更新的 LIANTI 技术）和 MDA（多重置换扩增），分别由北京大学、北医三院 [Huang J et al. Fertil Steril. 2014]和华大基因[Xu Y et al. Clin Chem. 2015] 主导研发，显 示了单细胞测序技术在植入前遗传学诊断临床实践中的潜力。
此外，体外成熟的卵母细胞发育潜能较差，流产率相对较高，且尚无有效改善措施。基于单细胞测 序对体内外成熟的卵细胞进行比较，为辅助生殖的持续优化提供了理论基础[Zhao H et al. Antioxid Redox Signal 2019]。
目前而言，受限于价格昂贵、大众认知不足、临床应用不成熟以及监管严格(表 2-5)，基于单细胞 技术的辅助生殖在我国的应用并不广泛，相关产业还有很大的上升空间。
表 2-5 国内 13 家第一批拥有胚胎植入前筛查资质的医院统计
产前诊断
孕妇血浆中胎儿游离细胞以及单细胞技术的发展，为单细胞的无创产前诊断提供了可能。日本科研人员从母体外周血样本中提取了游离的胎儿 CD45-CD14 细胞[Sato T et al. J Mol Diagn 2020]，使 用 scDNA-seq 对男女胎儿的遗传信息进行了识别，展现了单细胞无创产前诊断的潜力。目前单细胞无 创产前诊断尚未进入临床阶段。
