分化与发育的过程一直备受研究者们的关注，但机体内的每个细胞都处在一个动态变化的过程，我们很难通过实验的方法分离得到所有状态下的细胞。而单细胞测序技术的发展，为我们对细胞群体内的异质性和发育分化轨迹研究提供了新的方法。今天我们就跟随王老师一起来看一下BD SeqGeq™之单细胞测序数据拟时序分析。
什么是拟时序分析？
实际上，单细胞转录组测序的每个细胞都处在某个特定的分化状态，因此可将每个细胞都看作整个连续分化发育程序中的快照。不同状态的细胞连起来就是一个“轨迹”，类似根据时间关系判断出的发育轨迹变化，但这并不是真正的时间，而是通过基因表达来模拟细胞的发育演化过程，所以称为“拟”时序分析（Pseudotime analysis）。
目前拟时序分析最常用的方法 Monocle是由Trapnell实验室开发的，采用了无监督算法，将单个细胞按照拟时间排列在对应的轨迹上。Monocle根据基因的表达状况把样本分为多个分化状态下的细胞群（State），生成直观的谱系发育树状图。
BD SeqGeq™ 支持拟时序分析
BD SeqGeq™目前将Monocle v2.0整合为插件。用户可以通过插件安装的方式获取Monocle功能，运行简单，无需编写R代码，操作界面十分友好。下面就为大家详细展示如何在SeqGeq™中获取Monocle以及使用它进行拟时序分析。
下载Monocle插件
进入SeqGeq™插件网站FlowJo exchange, 下载最新版Monocle插件。
进入The Comprehensive R Archive Network（CRAN）网站https://cran.r-project.org/ 下载电脑兼容的R版本。如电脑已安装R，则不必重新安装。
运行Monocle
选中目标细胞群，打开Workspace-Plugin-Monocle插件，指定基因进行Monocle运算。
结果解读
Monocle运行结束后，会生成一系列的结果图形和数据表格。选定的细胞群下会生成不同State的细胞亚群；在软件基因集位置，可查看每个State亚群的主要驱动基因，这些基因集可导出供使用；在Layout界面，会自动生成一张Monocle结果图和不同State基因表达图；自动生成的结果文件夹可查看热图。
首先，可将细胞的每个群在Monocle树状图中展示出来。相似分化状态的细胞被聚到一起，每个分叉点代表一个可能的细胞命运的决策点。根据自己的实验背景，去判断哪个细胞群可能为分化起始点或终点。
在Layout界面，会自动跳转出Monocle结果。左图是细胞拟时间值的分布情况，由蓝到红拟时间值依次增大；右图是根据颜色排列的不同的细胞状态，能够查看每个状态对应的基因表达，结合细胞群的分布去判断可能的分化发育轨迹。
相应地，SeqGeq™也会同时生成每个State细胞群的基因表达情况。
输出的基因随拟时间表达的热图，表达相似的细胞会聚在一起，形成不同的State亚群，方便直观查看结果。
Monocle安装方法
关联SeqGeq™
将SeqGeq™与R安装的位置和SeqGeq™安装目录下 Plugin文件夹的位置进行关联，并将下载好的插件包中的Monocle.jar文件复制至关联的Plugin文件夹中。
安装Monocle
打开插件中包中How_to_Monocle PDF文件，复制安装命令至 R中进行安装。
R包安装完成后，重启SeqGeq™。
Reference：
Trapnell,Cacchiarelli et al. The dynamics and regulators of cell fate decisions arerevealed by pseudotemporal ordering of single cells. Nature Biotechnology.2014
