对单细胞转录组测序而言，组织解离后的细胞悬液需要进行单细胞分离，并通过微量扩增引入barcode和nique molecular identifier (UMI)实现分子标记，最终构建成符合上机测序要求的单细胞转录组测序文库。
同样是单细胞转录组测序，为什么会存在全mRNA转录组测序，3'端转录组测序和5'端转录组测序的区别？针对不同的科研需求，研究者又该如何选择适合自己的测序手段进行后续的科学研究？这一切都要从单细胞微量mRNA的富集和扩增说起。
一、揭开技术关键的神秘面纱
众所周知，RNA中80%是rRNA，因此，首先要解决如何高效富集总RNA中的mRNA的问题；其次，在单个细胞当中mRNA大约只有0.2pg（1pg=10-12g），为了达到高通量建库所需的μg（1μg=10-6g）水平，需要对mRNA进行扩增，同时要控制扩增过程中的PCR偏好性。
SMART方法（Switching Mechanism At 5' end of the RNA Transcript）利用反转录酶(Moloney murine leukemia virus)高效的解决了以上两大难题。
二、3种测序方式“才艺”大比拼
单细胞全mRNA转录组测序
单细胞全mRNA转录组测序通过Oligo(d)T与mRNA的poly(A)尾结合，完成对mRNA高效富集。接下来，逆转录酶以mRNA为模板合成cDNA第一链，在到达mRNA的5'端特有的“帽子结构”，即甲基化的G碱基时，会在第一链cDNA的5'端继续连接几个C碱基，以便在第二链扩增过程中，使扩增序列中的rGrGrG结构能够与cDNA第一链结合。这样就保证在后续扩增过程中，所有片段两端的扩增引物结合序列一致，降低了由不同扩增引物结合序列导致的PCR偏好性。后续即可进行建库工作并完成测序。
单细胞全mRNA转录组测序
3'端单细胞转录组测序
与单细胞全mRNA转录组测序技术不同，3'端转录组测序技术在磁珠上预先锚定含有Truseq Read1（双末端测序Read1测序引物结合序列）、Barcode、UMI和PolyT等结构序列，在高效富集mRNA的同时，对每个细胞和mRNA引入标签，这样就可以在后续的扩增过程中进行“混样”，达到对单细胞进行高通量测序研究。相对于全长mRNA测序技术，3'端测序在文库构建的打断过程中，只保留同时含有Barcode、UMI和部分mRNA 3'端信息的片段。
3'端单细胞转录组测序
单细胞V(D)J测序
接下来介绍的是单细胞V(D)J测序技术，由于V、D、J区域靠近mRNA 5'端，因此只需要在3'端单细胞转录组文库构建方法的基础上，对磁珠上的锚定序列结构进行简单调整即可。具体操作方法为，将原来游离的TSO-rGrGrG序列与原本锚定在磁珠上Oligo(d)T序列进行调换后，再进行后续的相应操作，打断后富集同时含有Barcode、UMI和V、D、J区域（或mRNA 5'端）信息的片段，最终构建成为V(D)J文库（或5'mRNA文库），进行后续的测序分析。
单细胞V(D)J测序
三、我们该如何选择测序方式？
3种单细胞转录组测序解决方案中，单细胞全mRNA转录组测序提高了对转录本的覆盖度，理论上能够获得mRNA的所有序列信息，但由于未能在mRNA富集的同时引入Barcode和UMI，导致所获文库无法用于高通量单细胞测序研究。而3'端单细胞转录组测序和5'端转录组测序由于对每个细胞和mRNA引入了分子标签，实现单细胞的高通量测序，但无法覆盖mRNA的所有序列信息。
正如我们在日常生活中，有些业务办理需要提供全部身份证号，但是在找回密码验证的时候，只需要身份证号后四位，在证明户口所在区域时，只要提供身份证号前6位即可。综合考虑不同测序方式，研究者们需要根据不同的研究需求做出取舍：选择单细胞高通量测序研究就要舍弃部分mRNA信息；保留全部的mRNA信息就不能进行单细胞高通量测序研究。因此，研究者根据具体的实验需求，选取最适合自己的测序方式才是关键！
