目前用于单细胞类型鉴定的工具有很多，我们认为比较适合大众直接上手使用的软件就是singleR了。那么，singleR到底是如何实现细胞注释的呢？今天，我们就一起来详细了解一下singleR。
Single R软件最早的文献报道是来自一篇肺部巨噬细胞研究的单细胞论文[1]。这篇文章作者多份实测数据证明了SingleR软件可以较好基于单细胞转录组数据对各个细胞进行鉴定。SingleR基础的工作原理很简单（图1）：
（1）输入没有注释的单细胞转录组数据；
（2）基于参考库中的marker基因对输入的细胞进行鉴定。软件默认自带了一些参考库，都是作者基于已经发表的单一种类的纯细胞转录组数据构建的。在文章的后面部分，我们会对这些数据的来源和类型进行介绍。
（3）输出鉴定结果。
图1 singleR工作原理示意图
这个介绍好像还是过于简单。有点类似你问我：如果把大象放进冰箱里。我回答：打开冰箱门，然后把大象放进冰箱，然后关上冰箱门。虽然回答了问题，但还是无法解决问题。下面，我们就更精细地了解下singleR软件对细胞进行鉴定的分析逻辑（下图）。
图2 singleR运算过程的详细逻辑
假设，现在我们有一个待鉴定的细胞X，利用SingleR与参考数据库（假设里面有A、B、C、D等多类细胞）进行比较完成细胞鉴定，其运算过程如下：
Step1:Marker基因集合建立
SingleR自带参考库中只是提供了各类细胞的转录组表达量信息，marker基因是基于每次分析过程选择作为参考的细胞重新计算。比如，如果你这次选择了参考库中10种细胞作为参考，下次选择参考库中15种细胞作为参考，那么得到的marker基因集是不同的。
SingleR中的marker基因挑选默认基于差异倍数。如果要计算A类细胞相关的marker基因，其判定原则是：
1）计算各个基因在A类细胞和其他细胞中表达量的中位数（因为参考库中，每种细胞都有大量重复，所以可以计算中位数），并以中位数计算表达差异倍数；
2）选取差异倍数最高的N个基因作为A类细胞的marke基因。这个指标N可以根据项目的情况优化调整。因为这个过程仅仅计算差异倍数，而不计算P值，也提高了软件的运算速度。当然，也可以选择用其他方法，例如秩和检验，但会降低运算的速度。
Step2：计算待鉴定的细胞与参考库中已知细胞表达量的斯皮尔曼相关性
相关性分析是一种我们熟悉的两组数据相似性判断的方法。某个待鉴定的细胞X与参考库中某个细胞的表达量相关性越高，说明待鉴定的细胞与参考库中的某个细胞相似，从而可以作为细胞鉴定的依据。这里有两点细节要补充下：
1）与参考库中各个类型的细胞进行相关性分析的时候，都只使用对应类型细胞的marker基因开展相关性分析，这样可以减少非marker基因的随机噪音，提高结果的特异性。
2）由于参考库中每类细胞都有多个生物学重复。因此，待鉴定的细胞与每类细胞都对应有多组相关系数的结果。如果待鉴定的细胞X与参考库中的A类细胞相关系数有高有低，软件该如何判断呢？这就涉及相关系数结果选择的问题。
如果待鉴定的细胞X与参考库中A类细胞的多个生物学重复计算得到多个相关系，那么就选择这组相关系数的80%分位数作为A类细胞与细胞X的相关系数。即最终细胞X与参考库中的每一类细胞只有1个相关系数，这就避免了参考库中数据异质性导致的误差。
Step3：获得第一轮的细胞鉴定结果并开始下一轮的判断
我们在人工进行单细胞鉴定的时候，常常会遇到某个亚群与2~3类细胞相似度差不多而难以做判断的情况。在相关系数计算中也会遇到相似的问题。
在第一轮完成相关系数计算后，有可能细胞X会与A类、C类、D类等相关系数都很较高且都差不多，比如都在0.29~0.3之间差异很少。如果鲁莽地在这个阶段选择相关系数最高的那类细胞作为鉴定结果，很可能会导致错误的判断。因此，singleR使用“淘汰原则”来逐步缩小范围，而非要求一步到位。在完成第一步相关系数计算后，先淘汰相关系数最小或者与相关系数最高值小0.05以上的细胞类型。
比如，原来我们参考库中有10类细胞，与细胞X相关系数最高的是0.3。那么相关系数小于0.25的细胞将被淘汰。假设淘汰后还剩下3种细胞。那么软件就再次基于这3种细胞构建参考库，回到以上的step1进行新一轮的marker基因筛选以及相关系数判断。直到最后一轮比拼只在两种细胞中开展，singleR软件才会选择参考库种相关系数更高的那个细胞类型作为细胞X的鉴定结果。
这个思路的优势在于在每次循环判定过程中，每类细胞的marker基因都是重新计算的，这有利于逐步提高对参考库中高度相似的细胞类型的区分能力，最终得出一个稳定可靠的鉴定结果。
以上介绍的1个未知细胞完成鉴定的过程。当然，这个过程对软件来说就是一瞬间完成的过程。如果我们导入的是10X单细胞转录组获得的5万个细胞，那么软件就将对5万个细胞分别独立完成以上的鉴定过程，最终会赋予每个细胞一种判定的细胞类型。
综合使用singleR完成细胞注释
自动化注释软件应该作为细胞注释的辅助工具而不是决定工具。所以，当我们得到singleR的细胞注释结果之后，我们还需要结合singleR的注释结果和Seurat的分群结果来综合完成细胞注释。
Seurat是一种不依赖任何先验信息的细胞分群方法。理论上，来自Seurat分群结果中同一亚群的细胞应该属于同一类型的细胞；例如图3-a，Seurat分群得到9个亚群（对应9种颜色）。如果将这些细胞再用SingleR进行注释，由于singleR是每个细胞进行独立鉴定，最终每个细胞也会得到一份鉴定结果；如图3-b，这批细胞基于singleR鉴定出了12种细胞。那么两套结果如何解读呢？可以参考3点原则：
图3 Seurat完成分群的单细胞可以进一步用SingleR对各个细胞进行注释
（1）以Seurat分群为主，SingleR注释为辅。Seurat毕竟是直接利用测序数据在没有任何假设的情况下分群的结果，理论上可以避免任何认为主观判定导致的偏差。而SingleR得注释，还是依赖于我们选择哪些细胞作为参考库，较多受到人为主观选择得干扰。所以，Seurat的结果有更高的可信度。
（2）少数服从多数。单细胞测序数据虽然总体比较准确，但数据量少，以及背景噪音的存在。所以少量细胞难以避免存在marker基因表达的波动，导致singleR鉴定（使用较少的marker基因）结果中的假阳性。所以，在某一亚群singleR鉴定结果中，各个类型细胞比例差异很大的情况下，遵从少数服从多数的原则。
（3）如果疑义或分歧，则继续细分。singleR毕竟还是比较可靠的方法，如果singleR得出的结果与Seurat出入很大，那么还是值得我们复查Seurat的结果去寻找潜在原因。
以上3个原则，我们以图3-a红圈中的深蓝色细胞的鉴定过程为例，进行解释。红圈中的细胞既然Seurat初步聚类结果在一个亚群里，那么我们先假设它们就属于一大类细胞。而红圈中细胞在singleR注释结果中（图3-b）对应Naïve B cell（大约占80%）l和Memory B cell（大约占19%）以及少量CD8 TCM cell（大约占1%）。
那么按照以上的原则1和原则2，我们相信Seurat聚类结果，红圈中应该属于一大类细胞且少数服从多数，所以红圈中的细胞类型统一被归类为B cell。少量CD8 TCM cell更可能是singleR软件注释过程中，少量细胞表达量的随机噪音导致的鉴定错误。
而singleR鉴定结果又暗示红圈中的细胞还可以进一步细分为不同子亚型的B细胞，那么我们就可以考虑对红圈中的细胞用Seurat进一步进行细分，应该还可以进一步分为至少2个子亚群，这里就用到了原则3。
甚至某些情况下，Seurat某个亚群中的细胞被singleR鉴定到两种差异较大的细胞且比例差不多（例如，某个Seurat亚群中的细胞70%被鉴定为B细胞，30%被鉴定为T细胞）。那么，就暗示我们有可能将两类不同的细胞聚类到一个亚群里了，那么本次分析的Seurat分群的参数还值得优化，需要进行重新分群。在参数优化后，我们期望可以得到一份与singleR注释结果更一致的Seurat分群结果。这里使用的也是原则3。
单细胞转录组经过多年发展已经渗透到了生物学、医学的各个研究领域，细胞注释作为最基础且重要的一步，人工注释的精力投入和结果收益比例实际是很高的，这也是近两年蜂拥出大量自动化注释软件的重要原因。伴随着既有研究数量的增加，自动化注释也会在今后的研究中发挥越来越大的作用。
参考文献：
[1] Dvir Aran, Agnieszka P Looney, Leqian Liu, and et al. Reference-based analysis of lung single-cell sequencing reveals a transitional profibrotic macrophage. Nat Immunol, 2019. 20(2):163-172.
