m6A regulator-mediated methylation modification patterns and tumor microenvironment infiltration characterization in gastric cancer
胃癌中m6A调节因子介导的甲基化修饰模式和肿瘤微环境浸润特征
IF：10.679 Molecular Cancer，2020
研究背景
m6A RNA甲基化广泛存在于mRNA、lncRNA和miRNA中，被认为是真核细胞内部修饰的最主要和最丰富的形式。m6A修饰是哺乳动物细胞中的一种动态可逆过程，受甲基转移酶，脱甲基酶和结合蛋白（‘writers’, ‘erasers’，‘readers’）的调节。据报道，m6A调节因子在多种生物学功能中起着至关重要的作用。肿瘤是由复杂的肿瘤微环境（TME）组成，该环境由肿瘤细胞及其周围的免疫和炎症细胞，肿瘤相关的成纤维细胞和附近的间质细胞组织微血管，以及各种细胞因子和趋化因子构成。最近，一些研究揭示了TME浸润的免疫细胞与m6A修饰之间的特殊关联，全面认识多种m6A调节因子介导的TME细胞浸润特征将有助于增进对TME免疫调节的了解。本篇研究整合了1938个胃癌样本的基因组信息，以全面评估m6A修饰模式，并将m6A修饰模式与TME细胞浸润特性相关联。
技术方法
1938个样本→m6A修饰模式的无监督聚类分析（m6Acluster A-C）→TME浸润细胞的统计→m6A修饰模式和TME浸润特性的关系→m6A表型相关基因的鉴定→m6A表型相关基因的一致性聚类分析→PCA算法量化m6A修饰表型（m6Ascore）→m6Ascore与TME浸润特征结合→m6Ascore与肿瘤体细胞突变结合→探索m6Ascore在 anti-PD-1/L1免疫疗法中的作用。
研究结果
1. 胃癌m6A调节因子的遗传变异概况
使用R（version 3.6.1）和R Bioconductor软件包对来自GEO和TCGA数据库的1938个胃癌样本进行分析，鉴定了8个writers，2个erasers和11个readers（图1A）。然后对来自ACGR的433个胃癌患者样本、21个m6A调节因子进行拷贝数变异分析，共发现101次突变，频率为23.33%（图1B），且CNV变异大多数都是拷贝数增加（图1C）。m6A调节因子的CNV变异在染色体上的位置如图1D。根据这21个m6A调节因子的表达，我们可以把癌症样品与普通样品完全区分开（图1E）。与正常胃组织相比，具有CNV扩增的m6A调节因子在胃癌患者组织中表现出明显更高的表达，反之亦然（图1F）。表明m6A调节因子的表达失衡在胃癌的发生和发展中起着至关重要的作用。
图1 胃癌中m6A调节因子的基因和表达变异
2. 21个调节因子调控的m6A甲基化修饰模式
对胃癌中m6A调节因子之间的相互作用进行分析发现，不仅同一功能类别中的m6A调节子在表达上具有显著相关，而且在writers, erasers, and readers之间也显著相关（图2A）。
图2A 21个m6A调节因子网络图
应用无监督聚类分析，根据21个m6A调节因子的表达，识别出不同的m6A修饰模式，并对患者进行分类，聚类的数量和稳定性由一致聚类算法确定。鉴定出三种不同的修饰模式，m6Acluster A-C（图2B）。
图2B 五组胃癌患者的m6A调节因子的聚类图
3. 不同m6A修饰模式下的TME细胞浸润特性
使用GSVA-R包进行GSVA富集分析，探索不同的m6A修饰模式之间的生物学行为。三种m6A修饰模式具有明显不同的TME细胞浸润特性（图3A）。Cluster A被归类为免疫排斥表型，其特征是先天免疫细胞浸润和基质激活。Cluster B被归类为免疫炎症表型，其特征在于适应性免疫细胞浸润和免疫激活。Cluster C被分类为免疫沙漠表型，其特征是抑制了免疫。
图3A 不同m6A修饰模式中生物途径的激活状态图
使用CIBERSORT方法来比较三种m6A修饰模式中免疫细胞的成分差异。发现三种m6A修饰模式之间的TME细胞类型组成没有显著差异，这表明m6A甲基化修饰不会改变肿瘤的TME浸润细胞类型（图3B）。
图3B m6A修饰模式中免疫细胞的成分图
4. m6A基因标签的产生和功能注释
为了进一步研究每种m6A修饰模式的潜在生物学行为，使用limma软件包确定了718个m6A表型相关的DEGs（差异表达基因）。使用cluster Profiler软件包对DEGs进行GO富集分析（图4），发现这些基因与m6A修饰和免疫力显著相关，证实了m6A修饰在肿瘤微环境中的免疫调节中起不可忽略的作用。
图4 m6A相关基因功能注释
通过采用无监督聚类分析重叠DEGs，将患者分为几类进行更深入的分析。鉴定了三种不同的m6A修饰基因组表型，命名为m6A gene clusterA-C，证明胃癌中确实存在三种不同的m6A甲基化修饰模式（图5A）。然后，使用单变量Cox回归模型对每个基因表型进行预后分析。300例胃癌患者中88例聚集在Gene cluster A，证明有更好的预后效果，Gene cluster B（107例）的预后较差（图5B）。在三个m6A gene cluster中，m6A调节因子表达具有显著差异，这与m6A甲基化修饰模式的预期结果一致（图5C）。
图5 m6A修饰基因组表型相关图
5. m6A相关表型的临床特征
考虑到m6A修饰的个体异质性和复杂性，基于这些表型相关基因，使用类似于GGI的方法构建了一套评分系统来量化单个胃癌患者m6A修饰模式，并将其称为m6Ascore。低m6Ascore与免疫激活显著相关，而高m6Ascore与基质激活相关（图6）。m6Ascore可以更好地评估单个肿瘤的m6A修饰模式，并进一步评估肿瘤的TME细胞浸润特性。
图6 m6Ascore，m6Acluster，ACRG分子亚型和gene cluster冲击图
接下来进一步确定m6Ascore在预测患者预后方面的价值，根据survminer软件包确定的临界值0.0291，将患者分为低或高m6Ascore组。m6Ascore低的患者表现出显著的生存获益，其5年生存率是m6Ascore高的患者的两倍（图7B）。m6Ascore还可预测胃癌患者辅助化疗疗效的能力，m6Ascore低的患者显示出显著的生存优势（图7C）。
图7 m6Ascore的预后分析
6. m6Ascore和肿瘤体细胞突变
使用Maftools软件包分析了TCGA中m6Ascore高和低之间体细胞突变的分布差异。低m6Ascore组（图8H）比高m6Ascore组（图8G）表现出更高的肿瘤体细胞突变率。TMB（肿瘤突变负荷）定量分析证实，低m6Ascore肿瘤与较高TMB显著相关（图8E）。m6Ascore和TMB也显示出显著的负相关性（图8F）。
图8 m6Ascore和肿瘤体细胞突变相关图
7. m6A修饰模式在anti-PD-1/L1免疫疗法中的作用
以PD-L1和PD-1阻断为代表的免疫疗法无疑已成为癌症治疗的重大突破。基于这两个免疫疗法研究m6Ascore是否可以预测患者对免疫检查点封锁疗法的反应。在anti-PD-L1（IMvigor210）和anti-PD-1（GSE78220）中，m6Ascore低的患者均表现出显著的临床效益，并且延长生存时间（IMvigor210，图9A；GSE78220，图9D）。 m6Ascore低的患者与m6Ascore高的患者相比，anti-PD-1/L1 免疫疗法具有显著的治疗优势和临床反应（图9B-C和E-G）。此外，m6Ascore较低的患者表现出PD-L1的明显高表达，表明对anti-PD-1/L1免疫疗法有潜在反应（图9H）。进一步的研究表明，在具有高m6Ascore的肿瘤中，调节性T细胞和TME基质被显著激活，这提高了肿瘤的免疫耐受性（图9I）。还评估了与免疫治疗功效密切相关的肿瘤新生抗原负荷（TNB）。我们发现低m6Ascore和高肿瘤新生抗原负荷的患者显示出巨大的生存优势（图9J）。以上暗示m6A修饰模式的量化是免疫疗法的预后和临床反应评估的潜在和强大的生物标志物（图9K）。已检测到IMvigor210队列中肿瘤的免疫表型，因此我们研究了不同表型之间m6Ascore的差异。我们发现，较高的m6Ascore与免疫豁免表型和免疫沙漠表型显著相关，免疫检查点抑制剂很难在这些表型中发挥抗肿瘤作用（图9L）。
图9 m6A修饰模式在anti-PD-1/L1免疫疗法中的作用相关图
讨论
本文鉴定了三种m6A修饰模式，在三种修饰模式下的TME细胞浸润特征与三种免疫肿瘤分类是一致的（免疫炎症型，免疫豁免型，免疫沙漠型）。证明了对单个肿瘤内m6A修饰模式的评估可以预测肿瘤炎症的阶段，亚型，TME基质活性，遗传变异和患者预后。低m6Ascore的特征是突变负荷增加和免疫活化，表明是免疫炎症型。在高m6Ascore亚型中观察到基质的激活和缺乏有效的免疫浸润，表明是免疫豁免型和免疫沙漠型，生存力较差。低m6Ascore也与增加新生抗原负荷和增强抗PD-1/L1免疫疗法的反应有关，m6Ascore较低的患者表现出显著的治疗优势和临床益处。这项工作表明m6A修饰在TME多样性和复杂性的形成中起着不可忽略的作用。评估单个肿瘤的m6A修饰模式将有助于增强我们对TME浸润特征的认识，并指导更有效的免疫治疗策略。
