大家好，今天和大家分享的是2020年3月发表在Journal for ImmunoTherapy of Cancer（IF=9.913）上的一篇文章：“LAG3 (LAG-3, CD223) DNA methylation correlates with LAG3 expression by tumor and immune cells, immune cell infiltration, and overall survival in clear cell renal cell carcinoma”，作者利用TCGA数据库的肾透明细胞癌（KIRC）数据进行分析，发现了编码免疫抑制分子LAG-3的基因的甲基化修饰与该基因在肿瘤和免疫细胞中的表达、免疫浸润以及总生存期的联系，并进一步在来自波恩大学附属医院（UHB）的KIRC样本中证实了这种联系，这一发现有望给LAG-3抗体疗法的临床试验提供参考。
LAG3 (LAG-3, CD223) DNA methylation correlates with LAG3 expression by tumor and immune cells, immune cell infiltration, and overall survival in clear cell renal cell carcinoma在肾透明细胞癌中，LAG3(LAG-3，CD223)DNA甲基化与LAG3在肿瘤和免疫细胞中的表达、免疫细胞浸润和总生存期有关。
一、研究背景
KIRC是最常见的恶性肿瘤之一。因为耐药性和低放射敏感性，在过去一段时间里，对晚期和转移性KIRC来说，肿瘤细胞减灭术是唯一有效的疗法。随着技术的发展，科学家发现了一些靶点，对其进行的靶向治疗可以改善KIRC患者的预后。作者希望探究一个潜在的靶点对应的LAG3基因的甲基化水平与基因表达，免疫浸润情况以及患者总生存期的联系，为LAG-3抗体疗法的应用奠定基础。
二、研究思路
三、结果解析
基因结构及CpG位点分布简介
- LAG3的基因结构如图1，该基因有共享一个转录起始位点的两个转录本，LAG3-201和LAG3-202，后者比前者少了三个外显子。启动子和它的侧翼序列以及转录抑制因子CTCF的结合位点的预测结果也展示在图中。
- 在16个CpG位点中，第1-12个位点在启动子和它的侧翼序列内，第二个位点被发现嵌入于启动子序列的CTCF结合位点中，第13和14个位点在LAG3-202的下游，第15和16个位点在LAG3下游的CTCF结合位点中。
图1：LAG3基因的结构
1.LAG3在KIRC和正常组织中的甲基化水平差异及共甲基化分析
甲基化作为文章的轴心，文章的论证都与其密切相关，所以作者首先需要获得LAG3在KIRC和正常组织中甲基化水平的差异。作者将KIRC组织和正常组织内的LAG3基因甲基化水平相比较，发现16个CpG位点中有14个存在甲基化水平的差异。在KIRC组织中，位于LAG3基因启动子和基因体的CpG位点的甲基化水平显著低于正常组织，但在LAG3基因下游序列的CTCF结合位点中，第15和16个CpG位点的甲基化水平却显著高于正常组织（表1，图2A）。
值得注意的是，CpG位点3-8,10-12的甲基化水平存在很强的正相关，提示以上位点存在高度共甲基化，而位点14、15相对于位点3-8,10-12则存在负相关 (图3E)。作者使用UHB的样本验证了CpG位点4和8的共甲基化情况 （TCGA数据: Spearman’s ρ=0.62, p<0.001; UHB样本: ρ=0.66, p<0.001）
表1：LAG3甲基化水平与mRNA表达及总生存期的关联
图2A.KIRC中LAG3的甲基化水平；2B.甲基化水平与免疫浸润情况；2C甲基化水平与γ干扰素信号通路
图2E.16个位点间甲基化水平的关联
2.LAG3甲基化与基因表达水平的相关分析
获得甲基化数据之后，作者想进一步探究甲基化与基因表达的关系，故将来自TCGA的KIRC甲基化和mRNA表达数据进行相关分析，发现在KIRC组织中，LAG3基因16个CpG位点中12个的甲基化水平与LAG3 mRNA的表达水平显著相关(表1)。
作者进一步分析发现，不同位点的甲基化对基因表达的影响不尽相同，LAG3基因启动子和基因体中CpG位点的低甲基化与LAG3 mRNA的表达上调相关 (图3A–C)。与之相反的是，LAG3基因下游序列的超甲基化与LAG3 mRNA的表达上调相关，这种相关性在位于CTCF结合序列的CpG位点15中尤其显著(图3D)
图3.LAG3表达与部分位点甲基化水平的关系
甲基化对基因表达的影响不仅限于肿瘤组织，正常组织LAG3基因的CpG位点10中存在显著的甲基化水平与mRNA表达的负相关；在KIRC细胞系LAG3基因的CpG位点11中，也存在这种负相关（表1）。
值得注意的是，KIRC细胞系中CpG位点13的甲基化水平与mRNA表达的正相关性没有在KIRC组织样本中出现，作者推测这种情况是肿瘤组织中同时含有免疫细胞和肿瘤细胞，而两种细胞表现的相关性相反而出现抵消。相应的，作者发现了外周血单个核细胞(PBMCs)中CpG位点13甲基化水平与LAG3 mRNA表达出现强负相关（表1）。
作者通过免疫组化染色发现一部分肿瘤细胞（32/118; 27.1%,图4A）恒定低水平表达LAG3，而LAG3阳性的免疫细胞很少，且主要是伴随恒定表达LAG3的肿瘤出现（22/118; 18.6%; Spearman’s ρ=0.62, p<0.001），值得注意的是，在正常的肾近端小管（图4A）和肾盂的尿路上皮细胞中也有LAG3的表达。
图4A.KIRC肿瘤组织及正常组织切片
作者通过上述结果证实了LAG3的表达与甲基化水平存在相关，且在来自UHB的样本中部分证实了这种相关性。
3.LAG3启动子甲基化水平与免疫浸润、基因表达的相关分析
因为LAG3是一个潜在的免疫检查点抑制剂作用靶点，故作者希望研究其与免疫浸润之间的联系来寻找突破，经过相关分析后，作者发现在KIRC组织中，LAG3基因启动子序列低甲基化水平与更多的免疫细胞浸润存在相关，这种相关性可以通过LAG3启动子处于低甲基化水平时CD4，CD8A和CD8B这几个探针测得的升高的mRNA水平得到支持 (图2B)。与之相反，在LAG3基因下游CTCF结合位点中的CpG位点15的超甲基化和更多的免疫细胞浸润存在相关(图2B)。注意以上结果是基于整体肿瘤组织的，包含了肿瘤细胞，肿瘤基质和浸润的免疫细胞，故可能有因第二点中提到的“抵消”情况而漏掉的相关性。
在外周血单个核细胞中，LAG3启动子表现为低甲基化，另一方面，在没有免疫细胞和肿瘤基质的肾细胞癌细胞系中，LAG3基因启动子表现为超甲基化(图2A)，从以上发现来看，整体肿瘤样本LAG3启动子的甲基化水平展示了肿瘤细胞和浸润的免疫细胞的综合情况，这个“平均”水平比外周血单个核细胞LAG3的甲基化水平要高，但比肾细胞癌细胞系LAG3的甲基化水平要低(图2A)
IFN-γ通路与机体抗肿瘤过程密切相关，故作者通过分析STAT1，STAT2，JAK2，IRF9这几个基因mRNA的表达与LAG3甲基化水平的关系评估了LAG3和IFN-γ信号通路的相关性，发现大部分处于LAG3启动子的CpG位点的低甲基化和处在基因体的CpG位点的超甲基化与IFN-γ信号通路的上调有强相关性，其中CpG位点14和15的甲基化水平和IFN-γ信号呈正相关 (图2C)。
在组织层面，作者通过实验验证了LAG3与免疫浸润的关系。通过免疫组化染色对LAG3，CD45，CD4和CD8分子进行标记，作者证明了来自UHB的样本中高表达LAG3的肿瘤组织有大量CD45 ，CD8 和CD4 细胞浸润（图4B）。
图4B.LAG3表达与否与免疫浸润情况
作者同时做了CpG位点4和8的甲基化水平与免疫浸润的相关分析，发现二者呈负相关，结合以上结果，这提示我们LAG3甲基化可能通过调节LAG3的表达来影响免疫浸润。
图4C.LAG3 CpG位点4和8甲基化水平与免疫标记分子的相关分析
4.LAG3甲基化水平与常见驱动突变的相关分析
因为驱动突变对癌症的发生起到关键作用，故作者探究了KIRC中驱动突变与LAG3甲基化水平可能存在的联系，作者的发现可能有助于进一步阐述LAG3与癌症发生及进展的相关性。作者分析从TCGA数据库中获得的KIRC数据发现，最常见的驱动突变发生于调控氧代谢和染色质修饰的基因，为VHL，PBRM1，SETD2，BAP1和KDM5C（突变频率分别约为：49.9%, 30.6%, 11.3%, 8.9%, 6.0%）。其中调控氧代谢的VHL基因的突变和LAG3基因的甲基化修饰不存在显著相关，但大部分调控染色质修饰的基因（尤其是PBRM1和BAP1基因）的突变与LAG3中某些CpG位点的甲基化存在关联(表2)，因为染色质修饰中包含了甲基化过程，这样的结果在预料之中，同时也为LAG3在肿瘤中甲基化水平的改变提供了新的解释。
表2：在KIRC的常见驱动突变中LAG3甲基化及mRNA表达水平
5.LAG3启动子甲基化和基因表达水平与KIRC患者总生存期分析
因为LAG3是一个潜在的免疫治疗靶点，研究它的最终目的是临床应用，所以作者最后将目光放到了临床层面。作者对来自TCGA的KIRC数据进行KM生存分析发现，16个CpG位点中10个的甲基化水平差异和总生存期显著相关（表1）。处在LAG3基因下游CTCF结合位点和基因体的CpG位点（13,14,15）超甲基化及处于LAG3基因启动子的CpG位点（3-7,10,11）低甲基化与更差的总生存期相关 (表1，图5)。
图5：基于不同甲基化和mRNA表达水平的KM生存分析结果
以上结果在来自UHB的样本中也得到验证，作者分析发现样本中CpG位点4和8的低甲基化与更差的总生存期显著相关（表1）。另外，作者发现LAG3表达及大量免疫细胞浸润的组具有更差的总生存期。(图4D)
图4D：LAG3不同表达水平与总生存期Cox回归分析
至此，作者的行文思路就很清楚了——作者先请出文章的主角：LAG3甲基化修饰，从TCGA数据库中KIRC肿瘤与正常组织的甲基化水平入手，发现了二者存在的差异，并在UHC样本中做了实验验证；随后，因为甲基化和基因表达密不可分的联系，作者继续使用数据库中的数据探究了甲基化修饰与基因表达的相关性，同时在UHC样本中用qMSP与免疫组化进一步证明了二者存在的相关；因为LAG3在先前的报道中与肿瘤免疫存在相关，作者探究了LAG3甲基化修饰、基因表达、免疫浸润三者的联系，并在UHB样本中复现出了生信分析得到的结果；再然后，作者在文章中插入了一个小支线，对LAG3甲基化与KIRC的常见驱动突变做了相关分析；最后，因为LAG3是一个潜在的免疫治疗靶点，故作者将目光放到了临床，通过Cox回归分析，发现了甲基化水平及基因表达差异对患者预后的影响。
小结
作者从TCGA数据库获得KIRC的甲基化，基因表达，临床随访，驱动突变等数据，通过网页工具及t检验，U检验，spearman相关性分析，KM分析法进行分析后，揭示了LAG3甲基化与LAG3在肿瘤和免疫细胞中的表达、免疫细胞浸润和总生存期的关联，并进一步在来自UHB的样本及对应的患者中证实了这一联系，甲基化水平→基因表达→免疫浸润→预后逐级串联，论证思路严谨，值得我们参考学习。
