今天跟大家分享的是2020年2月发表在Aging（IF：5.515）杂志上的一篇文章。在文章中作者通过重新分析癌症基因组图谱TCGA-PAAD（胰腺癌）数据库，发现了一个与转移相关的lncRNA。然后，验证了ENSG00000254041.1的表达情况和预后意义。而后功能检测显示，ENSG00000254041.1增强了PC细胞的增殖、迁移、侵袭和耐药能力。
标题：The lncRNA ENSG00000254041.1 promotes cell invasiveness and associates with poor prognosis of pancreatic ductal adenocarcinoma
lncRNA ENSG00000254041.1促进细胞侵袭性与胰腺导管腺癌预后不良有关
一.研究背景
大多数的胰腺癌（PC）患者是由于局部侵袭或广泛转移的导致的疾病。然而，肿瘤的侵袭和转移机制尚不明确。因此，在这一领域还需要进行一系列的研究，并提供潜在的标记物。
二.分析流程
三.结果解读
1.ENSG00000254041.1的表达与上皮细胞向间质转化的升高有关
作者利用ssGSEA基因特征评分评估TCGA-PAAD患者的转移特征评分(图1A)。然后作者进行了差异表达分析，筛选出了ENSG00000254041.1(图1B，表S1)。
为了验证ENSG00000254041.1的预后价值，作者接下来检测了24对肿瘤和对应癌旁组织样本中ENSG00000254041.1的差异表达。结果显示，与癌旁组织相比，ENSG00000254041.1的表达明显增加(图1C)。进一步分析发现，ENSG00000254041.1与包括SNAI1、SNAI2、VIM和ZEB1在内的EMT相关的基因转录本呈正相关(图1D)。
图1.ENSG00000254041.1在胰腺癌及邻近正常组织中的表达
表S1.高、低EMT特征评分的样本间差异表达基因（部分）
2.ENSG00000254041.1预后分析
作者采用RT-PCR检测70例肿瘤组织标本中ENSG00000254141.1的表达水平，根据ENSG00000254041.1的表达水平(以中位值作为截断值)将其分为两组。生存分析显示，低表达组具有更好的OS（图1A）。
单变量Cox回归分析，发现ENSG00000254041.1的表达和临床分期是预测预后的指标。多变量分析显示，ENSG00000254041.1的表达和肿瘤晚期(III/IV)仍然是临床结果的独立预测因素(图2B)。然后通过ROC曲线来评估ENSG00000254041.1表达和AJCC分期的生存预测的敏感性和特异性，结果发现将两者结合后所得的AUC更高(图2C)。
图2.ENSG00000254041.1是胰腺癌的预后标志物
3.ENSG00000254041.1对细胞周期和细胞增殖的影响
作者将siRNA转染进ENSG00000254041.1表达水平较高的2个PC细胞系(SW1990和BxPC-3)，而将过表达载体转染进ENSG00000254041.1表达水平较低Panc-1细胞系(图S1)。
- 在SW1990和BxPC-3细胞系中，ENSG00000254041.1表达下调时S期的百分比下降，G0/G1期的百分比升高，而在Panc-1细胞系中，ENSG00000254041.1过表达时S期的百分比升高，G0/G1期的百分比下降(图3A)。
- 细胞增殖实验也表明，下调ENSG00000254041.1抑制了SW1990和BxPC-3细胞系的增殖，而过表达ENSG00000254041.1促进Panc-1细胞的增殖(图3B)。
图3.ENSG00000254041.1对PC细胞的细胞周期和细胞增殖的影响
图S1.三个细胞系的ENSG00000254041.1的表达情况
4.ENSG00000254041.1通过调控SOX4的表达来驱动上皮-间质转化(EMT)
接着研究ENSG00000254041.1相关的通路，作者将GSE15471数据集作GSEA，EMT通路显著富集(图4A，图S2)。
- 作者然后作transwell实验来确定ENSG00000254041.1是否会影响PC的转移能力。在SW1990和BxPC-3细胞系中，ENSG00000254041.1表达的降低明显抑制了细胞的侵袭能力，而过表达ENSG00000254041.1则促进了Panc-1细胞的侵袭(图4B)。
- western blot结果显示，SW1990和BxPC-3细胞系中ENSG00000254041.1的表达下调，导致间质标志物(vimentin和Snail)显著下调，上皮标志物(E-cadherin)显著上调;而Panc-1细胞中的ENSG00000254041.1过表达，导致vimentin和Snail的上调，而E-cadherin的下调(图4C)。
这些结果都在表明，在PC中ENSG00000254041.1可能能驱动上皮-间质转化。
图4.ENSG00000254041.1驱动上皮-间质转化(EMT)
- 对ENSG00000254041.1RNA的表达与转移通路中mRNA作Pearson相关性分析，结果显示了该通路中SOX4的强相关性 (图5A)。
- 作者使用RT-PCR检测SOX4在10例肿瘤组织和10例正常组织中的表达。结果显示PC样本肿瘤组织中SOX4水平的显著升高(图5B)。
- 作者接着探讨ENSG00000254041.1是不是调控SOX4的表达来驱动EMT。结果显示：下调ENSG00000254041.1可以抑制SW1990和BxPC-3细胞系中SOX4的表达，而ENSG00000254041.1过表达可以增加Panc-1细胞系中SOX4的表达(图5C)。
图5.通过ENSG00000254041.1调控SOX4的表达
图S2.LncRNA ENSG00000254041与EMT通路的共表达分析
5.ENSG00000254041.1增强PC细胞对GEM的耐药
接下来作者进行了GSEA，以研究ENSG00000254041.1表达是否有助于PC患者的耐药。结果显示，在PC患者中，ENSG00000254041.1表达与多种耐药途径相关(图6A)。
作细胞生存分析，结果显示，敲除ENSG00000254041.1的SW1990和BxPC-3细胞系中GEM的IC50值降低，细胞存活状态差；而过表达ENSG00000254041.1的Panc-1细胞系中GEM的IC50值升高，细胞存活状态改善。说明ENSG00000254041.1可能增强PC细胞对GEM的耐药(图6B)。
图6.ENSG00000254041.1增强PC细胞对GEM的耐药
最后小结一下：在文章中作者通过重新分析癌症基因组图谱TCGA-PAAD（胰腺癌）数据库，发现了一个与转移相关的lncRNA。然后对ENSG00000254041.1的表达和预后意义作了评估和验证。而后利用SW1990、BxPC-3以及Panc-1三个细胞系验证了ENSG00000254041.1对PC细胞的促进增殖、迁移、侵袭和耐药能力。并发现了SOX4为潜在的调控机制。这项研究为PC的预后提供一个潜在的biomarker。
