欢迎关注”生信修炼手册”!
对于RNA_Seq而言，得到基因/转录本的定量结果仅仅是第一步， 只是对测序数据的汇总， 相同的工作也可以通过芯片直接得到。
无论是芯片也好，测序也罢，定量只不过是量化生物体内转录本的表达丰度，仅仅一个定量的结果并不能得到有效的生物学结论。为了回答生物学问题，还需要进行后续的差异分析。
由于定量的方式有很多种，比如raw count, TPM, RPKM/FPKM 等，不同的定量方式其表达量的分布是不同的，所以差异分析时采用的软件与算法也会不同。本文介绍DESeq2这个R包，主要是针对raw count的定量结果，进行差异分析。
软件的官网如下
https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq2.html
DESeq2要求输入的定量结果为raw count形式，raw count其实是根据reads数计算得到，所以要求必须全部是整数。
由于不同样本的测序量不完全相同，所以raw count无法在样本间直接比较，就是说同一个基因在样本A中的raw count大于样本B中的raw count , 并不意味这在A中的表达量就高，数值大可能是由于样本A测序的reads 总数大造成的。
为了在样本间进行差异分析，首先就需要对原始的raw count 表达量数据进行归一化。在DESeq2中，通过estimateSizeFactors函数为每个样本计算一个系数，称之为sizefactor, 示意如下
> dds <- makeExampleDESeqDataSet(n=1000, m=4)
> dds <- estimateSizeFactors(dds)
> sizeFactors(dds)
sample1 sample2 sample3 sample4
1.010543 1.033960 1.023026 1.001038具体的计算过程如下：
原始的表达量矩阵每一行代表一个基因，每一列代表一个样本，用counts表示，先进行log转换，转换之后，计算每个基因在所有样本中的均值，代码如下
loggeomeans <- rowMeans(log(counts))计算单个样本的sizafactor时，将该样本中每个基因的表达量减去对应的所有样本中的均值，然后取中位数。由于开始进行了log转换，最后在转换回来。 假定一个样本中所有基因的表达量为cnts, 代码如下
exp(median((log(cnts) - loggeomeans)[is.finite(loggeomeans) & cnts > 0]))需要注意的时，在计算中位数时，对基因进行了过滤，需要满足以下两个条件 1.在该样本中该基因的表达量大于0 2.在所有样本中该基因的表达量都大于0，而且取log之后的和不为0
实际上第二个条件已经包含第一个条件了，在原始的表达量矩阵中，肯定会有基因在部分样本表达量为0的情况，所以最终计算中位数时，只会用到部分基因。
计算出每个样本的sizefactor之后，将该样本原始的表达量除以该样本的sizefactor, 就得到了归一化之后的表达量。
对于raw count 的归一化，本质是消除不同样本测序总量不同的影响，反应到表达量矩阵上，就是每列的总和不同。DESeq2计算得到的sizefactor和每列的总和之间是一个线性关系，示意如下
所以sizefactors 能够用来进行归一化。
·end·
—如果喜欢，快分享给你的朋友们吧—
