已知miRNA定量原理揭秘

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在转录组的数据分析中，定量和差异分析是基础分析内容，对于mRNA的定量，直接将reads比对参考基因组进行定量即可，但是对于miRNA数据而言，这样的操作方式就不合适了。

miRNA长度在18bp-36b之间，非常的短，如果用这么短的reads比对整个基因组，肯定会有多个比对上的位置，在定量时，无法有效区分reads到底来自于哪一个miRNA,而且gtf文件中只会记录miRNA基因的基因组位置，并不提供5’和3’端两个成熟的miRNA的基因组位置。

为了准确对miRNA进行定量，mirdeep软件的开发者提出了这样一种思路，将reads 比对miRNA的前体序列，这样可以有效判断reads到底属于哪一个miRNA；其次，考虑到一个miRNA前体可以产生两个成熟的miRNA,根据reads的比对位置来区分两个成熟的miRNA, 示意图如下

在最开始研究miRNA的时候，发现一个miRNA前体可以产生两个小的RNA, 将其中表达量高的一个称之为mature miRNA, 将表达量相对较低的称之为star miRNA, 在后来直接将两个RNA都称之为mature miRNA了，mirdeep软件中依然采用了star序列的命名方式，实际是都是miRNA的序列。

在实际操作时，通过bowtie1进行比对，bowtie1对于短序列的比对任务灵敏度更高，适用于miRNA这种短序列的比对工作，首先对miRNA前体构建索引，代码如下

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bowtie-build precursor.converted miRNA_precursor

接下来，将成熟的miRNA比对到miRNA前体上，代码如下

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bowtie -p $threads -f -v 0 -a --best --strata --norc miRNA_precursor mature.converted ${name1}_mapped.bwt

最后，将miRNA测序的reads比对到miRNA前体上，代码如下

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bowtie -p $threads -f -v $mismatches -a --best --strata --norc miRNA_precursor $name2.converted ${name2}_mapped.bwt

根据两个比对产生的结果文件，就可以对miRNA进行定量，首先从成熟miRNA的比对结果中，确定成熟miRNA在miRNA前体上的位置, 比对结果示意如下

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hsa-miR-550b-2-5p         hsa-mir-550b-1    15    ATGTGCCTGAGGGAGTAAGACA    IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII    1    
hsa-miR-550b-3p         hsa-mir-550b-1    57    TCTTACTCCCTCAGGCACTG    IIIIIIIIIIIIIIIIIIII    1

对于hsa-mir-550b-1这个前体而言，有hsa-miR-550b-2-5p和hsa-miR-550b-3p两个成熟的miRNA，hsa-miR-550b-2-5p比对到了前体的15-36bp的位置，hsa-miR-550b-3p比对到前体的57-76bp的位置，这个位置是根据第4列的值加上第五列的序列长度得到的。

接下来从测序reads的比对结果，确定每个miRNA的表达量，比对结果示意如下

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SW1_224845_x3         hsa-mir-550b-1    17    GTGCCTGAGGGAGTAAGAGA    IIIIIIIIIIIIIIIIIIII    4    18:C>G
SW1_287750_x2         hsa-mir-550b-1    18    TGCCTGAGGGAGTAAGAGA    IIIIIIIIIIIIIIIIIII    4    17:C>G
SW2_152540_x1         hsa-mir-550b-1    17    GTGCCTGAGGGAGTAAGACT    IIIIIIIIIIIIIIIIIIII    2    19:A>T
SW2_152541_x7         hsa-mir-550b-1    17    GTGCCTGAGGGAGTAAGAGA    IIIIIIIIIIIIIIIIIIII    4    18:C>G
SW2_199319_x1         hsa-mir-550b-1    18    TGCCTGAGGGAGTAAGAA    IIIIIIIIIIIIIIIIII    4    17:C>A
SW3_404761_x1         hsa-mir-550b-1    17    GTGCCTGAGGGAGTAAGAGA    IIIIIIIIIIIIIIIIIIII    4    18:C>G
SW3_516112_x1         hsa-mir-550b-1    18    TGCCTGAGGGAGTAAGAGA    IIIIIIIIIIIIIIIIIII    4    17:C>G
SW4_451132_x4         hsa-mir-550b-1    17    GTGCCTGAGGGAGTAAGAGA    IIIIIIIIIIIIIIIIIIII    4    18:C>G
SW4_589021_x1         hsa-mir-550b-1    18    TGCCTGAGGGAGTAAGAGA    IIIIIIIIIIIIIIIIIII    4    17:C>G

我们可以看到，在实际测序的样本中，有这么多reads比对到了hsa-mir-550b-1这个前体；接下来的任务就是区分这些reads到底属于哪些成熟的miRNA。

从比对结果可以很明显看到，实际测序的reads在前体上的位置都是在17-36bp之间，对于这个区间而言，只能是hsa-miR-550b-2-5p这个成熟的miRNA。

为了加快比对过程，mirdeep对测序reads进行了处理，合并了冗余reads，用序列标识符中x后面的数字代表在原始测序结果中该reads出现的次数，最终计数时，直接把x后面对应的数字相加就可以了。

mirdeep软件是miRNA分析中非常经典的一款软件，了解其定量原理有助于我们更好的理解miRNA数据分析过程。

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