大家好，这次给大家分享一篇2020年3月发表在J. Cell. Physiol杂志上的文章，影响因子4.522。同样是非癌症类的文章，重点研究成骨细胞分化中起到功能性作用的lncRNA。
标题：Identification of functional lncRNAs based on competing endogenous RNA network in osteoblast differentiation
基于ceRNA网络的成骨细胞分化功能基因的鉴定
ODLMN：成骨细胞分化相关的lncRNA-mRNA网络
hMSCs：骨髓间充质干细胞
lncRNA：长非编码RNA
TFs：转录因子
研究流程图
摘要
背景：成人骨髓间充质干细胞具有向成骨细胞分化的潜能，在骨再生和修复中起着至关重要的作用。一些转录因子（TFs），如BMP-2和RUNX2，已经被证明可以控制分化过程。在成骨细胞分化过程中发现更多的关键调控因子是非常重要的。最近，一些研究发现长非编码rna（lncRNAs）参与成骨细胞分化，如MALAT1、DANCR和ANCR。
方法：在这项研究中，通过整合microRNA（miRNA）-RNA相互作用、基因共表达和蛋白质-蛋白质相互作用来研究lncRNA-信使RNA（mRNA）的串扰。首先，对成骨细胞分化相关的lncRNA-mRNA网络（ODLMN）进行多重拓扑分析。一些具有中心拓扑结构的lncrna被确定为关键调控因子。
其次，在ODLMN中进行模块搜索后，发现了两个功能模块，它们通过参与PI3K/蛋白激酶B、环腺苷酸3、5-磷酸和缺氧诱导因子1途径发挥了关键作用。第三，确定了核心lncRNA-TF干扰的一个子集，该干扰可以形成反馈环来控制成骨细胞分化的生物学过程。
结论：这些核心的lncRNA-TF反馈环比其他lncRNA显示出更多的TF结合亲和力。这些结果有助于揭示骨再生修复的分子机制，为骨再生修复提供新的靶点。
1. 差异表达lncRNA和基因的鉴定
在本研究中，针对GPL570平台执行了一个探针重新记数演算法。简单地说，从Affymetrix下载了探针序列，并使用BLASTn工具将探针和lncrna/基因之间的序列对齐。基于严格阈值重新标记探针-基因和探针-lncRNA对。结果，大约14000个探针-基因对和大约4000个探针-lncRNA对被重新标记。从GEO获得成骨细胞分化相关基因表达谱（GSE18043），其中包含3个对照骨髓间充质干细胞（hMSCs）和10个地塞米松处理的hMSCs。根据再标记结果，进行SAM试验以鉴定差异表达基因和lncrna。结果发现，1017个差异表达基因和662个差异表达的lncrna在| log2（fold change）|>1或p<0.01的阈值处是成骨细胞分化过程的潜在调节因子。
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2. ODLMN的构建与分析
将差异表达的lncRNAs-mRNAs和miRNA-靶点相互作用整合构建ODLMN。提取1187对p<0.01的显著lncRNA-mRNA。ODLMN是通过合并所有lncRNA-mRNA对和PPI对构建的，包括77个lncRNA节点、361个mRNA节点和1216个边缘（图1）。
图1
3.ODLMN的拓扑特性
对ODLMN进行拓扑分析，以确定调节性lncrna的生物学功能。网络度分布分析发现所有节点都服从幂律分布（图2a），这表明ODLMN网络是一个无标度网络。一小部分枢纽基因与ODLMN中的大多数基因相连。通过计算ODLMN和随机网络的平均路径长度和簇系数发现真实网络的聚类系数小于随机网络的聚类系数（图2b），说明ODLMN中存在紧密连接的模块。实际网络的平均路径长度明显大于随机网络的平均路径长度（图2c），表明ODLMN降低了全局效率。研究发现，生物网络中具有中心拓扑特征的节点在生物过程中起着关键作用。因此，分别计算了网络中节点的拓扑特征，如度、介数和贴近度。选择每个拓扑特征的前20个关键节点，发现三个特征中有五个lncRNA相交（图2d）。进一步分析五个lncRNAs的功能（图3a-e）表明，这些lncRNAs参与了多种信号传导途径，如Ras、磷酸肌醇3激酶（PI3K）、血管内皮生长因子（VEGF）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）。这些结果表明，关键的中枢基因位于ODLMN的中央，调节成骨细胞分化的多个过程。
图2
图3
4. ODLMN中功能模块的识别
以往的研究表明，lncRNAs可以通过参与紧密的模块发挥生物学功能。因此，作者使用插件“MCODE”来标识ODLMN中的功能模块，并标识了两个功能模块。模块1包括90个节点（17个LNCRNA和73个MRNA）和183个边（图4a）。在模块中对mRNAs进行路径富集（图4b）。模块2包含81个节点（12个LNCRNA和69个TFs）和143个边（图4c）。路径富集结果显示，该模块与基础功能和成骨细胞分化有关，如“HIF-1信号通路”、“Ras信号通路”和“PI3K信号通路”（图4d）。
图4
5. lncRNA-TF反馈回路的识别
大量研究表明，TFs能直接调节分化潜能。此外，TFs能与lncRNAs的DNA调控元件结合，激活/抑制lncRNAs的表达。因此，作者提出了lncRNAs和TFs是否可以通过结合ceRNA和TF组成反馈环来调节成骨细胞分化的假说。为了研究TFs与lncRNAs之间的结合模体，对所有lncRNAs的DNA调控元件（增强子和启动子）进行了模体扫描分析。结果发现TFs分别与lncRNA增强子和启动子结合（图5a，b）。在增强子区域，TF、FOS、KLF15和HOXC13具有针对lncrna的最多的结合位点（图6a）。在启动子区域，KLF15、SREBF1和EN2具有最多的结合位点，并与大多数lncrna结合（图5b）。SREBF1被认为是脂肪细胞分化和PI3K通路的调节因子，也是成骨细胞分化的重要调节因子。这些结果表明，一些海绵状TFs可能通过与lncRNAs的增强子和启动子结合，形成“反馈环”参与成骨细胞分化，发挥核心TFs的作用。此外，作者还比较了ceRNA对与其它对TF结合区的数目。结果表明，在增强子和启动子区域，TFs与ceRNA介导的lncRNA伴侣的结合亲和力强于其他lncRNA伴侣（图5d，e）。共鉴定出43对共36个基因（13个TFs和23个lncrna）。这些反馈环可能在维持成骨细胞特性方面起着关键作用（图5c）。
图5
网络研究一直是生物信息领域的热点，再加上火了很久的lncRNA，可谓强强联合！想研究网络分析的小伙伴们可以仔细研读一下这篇文章，会学到很多东西的！
