上文FEMS综述——土壤微生物生态学的已知和未知中，提到了rpb2基因作为真菌扩增子测序的另一种marker选择。本文对rpb2进行说明。
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摘要
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ITS受到rDNA拷贝数(1–200)和旁系同源(paralogues)的影响。另外由于高度的可变性，ITS不可用于相距很远物种的系统发育分析。
second largest subunit of RNA polymerase II (rpb2)为单拷贝，是另一种marker的候选。
本文比较了rpb2和ITS区域对mock community和云杉森林表层土真菌群落的影响。
结果表明，虽然也会受到旁系同源的影响，rpb2的覆盖度很高，且有足够的变异用于系统发育和物种类别分析。
rpb2和ITS得到的物种差异很大。
rpb2对Basidiomycota的检测比ITS1/ITS4要准确很多。
rpb2在判别能力、群落组成的定量表征以及系统发育分析的适用性都具有显著优势。
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方法
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rpb2在NCBI的30780个物种中被表征了6378个（截止到作者统计）,但是目前仍缺乏rpb2的通用引物。本文的引物为basidiomycete-specific引物，优先扩增担子菌。原因是这类菌含有更高的rDNA变异及在研究区域的森林垃圾和土壤中是优势种。引物为:
bRPB2-6F
(TGGGGYAT GGTNTGYCCYGC);
bRPB2-7R
(GAYTGRTTRTGRTCR GGGAAVGG)。
扩增长度500-800bp。
ITS扩增ITS1和ITS2全长，引物为:
ITS1
(TCCGTAGGTGAACCTGCGG)
ITS4
(TCCTCCGCTTATTGATATGC)
SEED pipeline进行数据质控。Uchime检测嵌合体。环境样本嵌合体比例为：24.3% in the ITS dataset; 0.3% in the rpb2 data set。最终Resample数为4457。
还考察了130个物种组成的mock community(83 from Basidiomycota, 42 from Ascomycota and five from other fungal groups)，提取物种DNA等比例混合。嵌合体比例为：7.4% in the ITS data set ; 1.3% in the rpb2 data set。最终Resample数为7668。
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环境样本结果
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1覆盖度
ITS(检测出21个纲)和rpb2(检测出28个纲)覆盖度都比较高，但是rpb2更高。
ITS得到更多的Ascomycota; Basidiomycota两者差不多。
不同纲水平上OTU和序列的绝对丰度(a)和相对丰度(b)
2多样性
OTU数量和chao1值ITS显著高于rpb2。Shannon–Wiener和evenness没有显著差异。
不同相似性水平下划分OTU的差异
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Mock结果
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ITS得到的OTU数量（275）多于rpb2（177）。68个物种在两种引物中都能扩增，而29和33个物种分别只在rpb2和ITS中得到。
主要的真菌类群(Ascomycota, Basidiomycota, Mortierellomycotina, Mucoromycotina)丰度相似。
ITS严重高估了OTU数量和Basidiomycota的丰度。
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讨论和总结
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“
rpb2在环境样本中得到物种类别更多。但是得到非真菌的序列也远远多于ITS（61% vs. 1% of reads）。
”
“
Mock群落中，rpb2均匀度更高。多种因素都会影响均匀度，如引物特异性、PCR偏好、DNA质量及其他因素。
”
“
basidiomycete 比例相似(ITS: 51%, rpb2: 58% of allreads)，表明两种引物对Dikarya (Ascomycota and Basidiomycota)覆盖度相似。
”
“
ITS得到的的singleton更多。可能因为ITS基因内部的变异更强，导致了OTU的高估；另外ITS理论上基因内部的旁系同源也更多，也会得到更多的singletons和OTU。虽然rpb2也会存在旁系同源，但是目前其旁系同源基因还未报道。
”
“
另外，rpb2几乎不含内含子，是相较ITS的另一个优势。
在之前文章文献解读—AEM：通过改良Illumina扩增子测序的种系特异性引物准确检测真菌群落多样性与丰度中，图1展示了SSU区域可能出现内含子的情况。
”
总结一下，对marker的选择，比较重要的考虑因素包括：容易扩增；覆盖度和特异性；拷贝数；旁系同源。
后记
本文目前被引用了28次。我查看了所有引用他的文章，有4本书，6综述，8研究性文章，1篇博士论文，1篇硕士论文，2篇methods，还有其他无关的几篇。其中只有两篇真正用到了rpb2。
这篇用到了rpb2,也是和ITS比较。区分C.islandica的能力上rpb2优于ITS。
Xu, M. N., Heidmarsson, S.,Thorsteinsdottir, M., Kreuzer, M., Hawkins, J., Omarsdottir, S., &Olafsdottir, E. S. (2018). Authentication of Iceland Moss (Cetraria islandica)by UPLC-QToF-MS chemical profiling and DNA barcoding. Food Chemistry, 245, 989-996. doi:10.1016/j.foodchem.2017.11.073
这篇基于rpb2对所有真菌进行了系统发育分析。
Tedersoo, L., Sanchez-Ramirez, S.,Koljalg, U., Bahram, M., Doring, M., Schigel, D., . . . Abarenkov, K. (2018).High-level classification of the Fungi and a tool for evolutionary ecologicalanalyses. Fungal Diversity, 90(1),135-159. doi:10.1007/s13225-018-0401-0
另外还看了一下bRPB2-6F/bRPB2-7R出现的文章。发现这对引物在更早的时候已经出现了。
Matheny, P. B. (2005). Improvingphylogenetic inference of mushrooms with RPB1 and RPB2 nucleotide sequences(Inocybe; Agaricales). MolecularPhylogenetics and Evolution, 35(1), 1-20. doi:10.1016/j.ympev.2004.11.014
The region between conserveddomains 6 and 7 of RPB2 (Denton et al., 1998; Liu et al., 1999) was amplified and sequenced using degenerate basidiomycetespecific primers bRPB2-6F and bRPB2-7.
后后记
综上所述，虽然很多综述都提及了这种方法，但是目前几乎还没有将rpb2直接用于环境样本的。虽然有着单拷贝的优势，但是无通用引物；及真菌rpb2基因鉴定的不完善等原因均制约了其应用。想要动摇ITS的地位还为时尚早呢~
Reference
Matheny,P. B. (2005). Improving phylogenetic inference of mushrooms with RPB1 and RPB2nucleotide sequences (Inocybe; Agaricales). MolecularPhylogenetics and Evolution, 35(1), 1-20. doi:10.1016/j.ympev.2004.11.014
Tedersoo,L., Sanchez-Ramirez, S., Koljalg, U., Bahram, M., Doring, M., Schigel, D., . .. Abarenkov, K. (2018). High-level classification of the Fungi and a tool forevolutionary ecological analyses. FungalDiversity, 90(1), 135-159. doi:10.1007/s13225-018-0401-0
Vetrovsky,T., Kolarik, M., Zifcakova, L., Zelenka, T., & Baldrian, P. (2016). Therpb2 gene represents a viable alternative molecular marker for the analysis ofenvironmental fungal communities. MolecularEcology Resources, 16(2), 388-401. doi:10.1111/1755-0998.12456
Xu, M.N., Heidmarsson, S., Thorsteinsdottir, M., Kreuzer, M., Hawkins, J.,Omarsdottir, S., & Olafsdottir, E. S. (2018). Authentication of IcelandMoss (Cetraria islandica) by UPLC-QToF-MS chemical profiling and DNA barcoding.Food Chemistry, 245, 989-996.doi:10.1016/j.foodchem.2017.11.073
一个环境工程专业却做生信分析的深井冰博士，深受拖延症的困扰。想给自己一点压力，争取能够不定期分享学到的生信小技能，亦或看文献过程中的一些笔记与小收获，记录生活中的杂七杂八。
