Journal：Fungal Ecology
Year：2015
IF：3.99
微生物测序得到的singletons和doubletons到底是真实的稀有种（rare species）还是假物种（artifacts）一直存在争议。
此文对全球16个不同的真菌的测序研究结果进行了研究，包含了不同的扩增区域(LSU,ITS1, ITS2)、测序技术及化学成分(454-FLX,454-Titanium, Illumina-MiSeq)。
结果表明平均38%的singletons是可能的或潜在的artifacts。大部分的singletons能划分到低水平的分类单元中(32 % of sequences to genus with 90 % bootstrap cutoff).
这项研究使得我们在完全（en masse）丢弃singletons的时候要小心，可能会低估多样性。
16个研究包括：
5个ITS1 [454-FLX(3) 和454-Titanium(2)]
6个ITS2(Illumina-MiSeq)
5个LSU (454-Titanium)
OTU划分为artifact的标准：
1. 门水平上为unclassified。不过很多uncultured的菌在门水平也没有注释信息，这部分的结果会使得artifact数量偏高；
2. 自举法得到的门水平上的注释可信度（bootstrap support）低于50%；
3. ITS序列不在ITS1或ITS2区；
4. 这一条我没看明白：Furthermore, sequences from the ITS1 libraries were considered artifacts if these conditions were met for taxonomy labels from both reference databases。
另外，自举法得到的科水平上的注释可信度（bootstrap support）低于50%的划分为potential artifacts。
前人研究表明~80%的singletons都可能是artifacts，但是本文整体的结果表明artifacts的比例不到一半。
不同扩增区域之间差别也比较显著。最高的为LUS，artifacts的比例为54.8%。
和前人结果差异的原因可能有两个：
1. 之前的研究包含了BLAST-based post hoc chimera check。在得到OTU后再次进行BLAST比对，检测并去除残留的嵌合体。但是这种方法依赖于参考数据库，可能会造成偏差。
2. 物种分类的方法不同。本研究用Naive Bayesian Classifier,而之前的研究用的是系统发育分析。 由于稀有物种在整个群落中的作用并不强，作者最终还是建议去掉所有的singletons，并且可以在此基础上去掉更多的低丰度序列，如丰度小于10的序列。
END
