基因型填充前的质控条件简介

影响基因型填充准确率的因素有很多，比如分型结果的质量，填充软件的选择，reference panel的选择，样本量的大小， SNP的密度等等。

为了提高填充的准确率，我们需要在填充前进行质量过滤。对于原始的分型结果，可以根据一些条件进行筛选和过滤，得到高质量的分型结果，用于后续的填充。

分型结果本质上是一张由样本和SNP位点构成的表格，对应的过滤手段也分成了两个大的方向，针对SNP位点的过滤和针对样本的过滤。

这里的质控条件和GWAS分析的质控条件是一致的，本文基于case/control的GWAS分析，讲解下常用的过滤条件。对于SNP位点的过滤，常用的过滤条件如下

1. missingness

在原始的分型结果中，会有部分分型失败的位点，称之为missing data。分型成功的比例称之为call rate, 根据snp call rate进行过滤的代码如下

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plink 
--noweb 
--file test 
--geno 0.1 
--out filter

--geno指定snp位点分型失败比例的阈值，分型失败的比例大于该阈值的位点会被过滤掉。

2. Hardy-Weinberg equilibrium

GWAS假设样本群体是符合哈温平衡的，对于不符合哈温平衡的SNP位点，需要过滤掉。

需要注意的是，哈温平衡的计算是针对群体的，在case/control中，如果合并一起计算hwe, 该位点的不平衡很可能是由于两个群体间的差异构成，过滤之后会造成后续分析的假阴性，所以只需要针对control组的样本计算hwe, 然后进行过滤就可以了，代码如下

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plink 
--noweb 
--file test 
--hwe 0.000001 
--out filter

--hwe指定哈温平衡检验pvalue的阈值，小于该阈值的位点会被过滤掉。

3. minor allele frequency

MAF过低可能是由于分型算法不能够检测到对应的allel引起的, 比如测序深度或者荧光信号强度不够等因素，此时这些位点的分型结果是不太准确的，所以需要过滤。

其次为了能够有效进行后续的GWAS挖掘，要保证不同allel对应的样本量的大小。MAF<1%的突变称之为rare variants, 相比MAF > 5%的common variants, 罕见变异需要更大的样本量，当样本量不足时，会造成后续分析的假阳性，所以在样本量较小的情况下，不能够有效进行罕见变异的GWAS分析，需要去除。

过滤的代码如下

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plink 
--noweb 
--file test 
----maf 0.01 
--out filter

--maf指定MAF过滤的阈值，小于该阈值的位点会被过滤掉。

对于样本的过滤，常用的过滤条件如下

1. missingness

和SNP的call rate类似，只是换成了样本中的比例，过滤的代码如下

代码语言：javascript复制

plink 
--noweb 
--file test 
----mind 0.01 
--out filter

--mind指定样本分型失败比例的阈值，分型失败的比例大于该阈值的样本会被过滤掉。

2. gender check

通过样本的分型结果可以判断样本的性别，plink默认F值小于0.2的为女性，大于0.8的为男性，然后与该样本标记的性别进行比较，如果二者不一致，则需要去掉该样本，代码如下

代码语言：javascript复制

plink 
--noweb 
--file test 
--check-sex 0.2 0.8 
--allow-no-sex 
--out gender

运行成功后输出一个后缀为genome的文件，在该文件中，如果性别一致显示OK, 否则显示PROBLEM。在某些情况下，默认阈值可能过于严格，可以调整check-sex后面的参数。

识别到不一致的样本之后，可以将对应的样本ID整理到一个文件中，每行一个ID,然后通过下列代码进行过滤

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plink 
--noweb 
--file test 
--remove sample.list 
--out filter

3. IBD

IBD用于衡量样本间的亲缘关系，亲缘关系较近的样本分型结果非常相似，极端的例子就是重复样本。GWAS分析的本质是一个无放回的抽样，需要保证样本间的独立性，所以亲缘关系较近的样本需要被去除。计算样本间IBD距离的代码如下

代码语言：javascript复制

plink 
--noweb 
--file test 
--genome 
--allow-no-sex 
--out ibd

4. heterozygosity and inbreeding

在一个随机交配产生的符合哈温平衡的群体中，样本是具有一定的杂合基因型的，近亲繁殖会导致纯合基因型的出现，产生的后代样本杂合度降低，导致群体哈温平衡的偏离，这样的样本需要被去除，保证GWAS分析中群体符合哈温平衡的假设。

另外，杂合度过高的样本可能是实验阶段混合了两个样本的DNA导致的，所以也需要去除。实际操作中，通过近亲系数F来表征, F值的大小与样本杂合度呈负相关，F值越大，对应杂合度越低。通过下列代码可以计算样本的近亲繁殖系数

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plink 
--noweb 
--file test 
--het 
--allow-no-sex 
--out het

然后通过F值的分布来确定过滤的条件。

5. population stratification

群体分层指的是在样本中明显分成了多个亚群，亚群之间的差异会影响case/control组间差异的判断，对GWAS分析造成影响。对于群体分层，可以在后续GWAS分析中进行校正，这里的过滤指的是过滤掉个别明显偏离的离群值样本，可以通过主成分分析PCA或者MDS分析来实现，对应的方法比较多，后续在详细讲解。

除了这些过滤条件外，还需要调整SNP的方向，在reference panel中，SNP位点分型结果以参考基因组正链上的碱基表示，而在分型结果中会出现既有正链又有负链的情况，需要统一校正到正链上来。

对原始分型结果进行质控，可以提高基因型填充的准确率，进一步保证后续GWAS分析的准确性。

case panel reference

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