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本文解读的文献标题如下
The circRNA circAGFG1 acts as a sponge of miR-195-5p to promote triple-negative breast cancer progression through regulating CCNE1 expression
通过高通量测序和后续的功能验证，挖掘出三阴性乳腺癌中的一个ceRNA调控功能网络，网址如下
https://molecular-cancer.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12943-018-0933-7
三阴性乳腺癌是最为恶性的一种乳腺癌亚型，占所有乳腺癌病理类型的15%左右，对应癌组织的免疫组织化学检验结果为雌激素受体(ER), 孕激素受体(FR), 原癌基因(Her-2)三者均为阴性，其名称也由此而来，简称TNBC。该疾病在年轻女性中更为常见，由于缺少相应的分子靶点研究，化疗是目前唯一有效的治疗方式，但是复发率高，而且预后效果差。
环状RNA是一类新星的非编码RNA,具有重要调控功能，相关研究表明，环状RNA在多种疾病，尤其是肿瘤的发生和发展中发挥重要作用。环状RNA可以作为miRNA sponge, 与miRNA结合，从而和该miRNA的其他靶标分子形成竞争关系，构成ceRNA调控网络，关于ceRNA机制的研究在多种癌症中被报道。
本文以环状RNA在三阴性乳腺癌中的作用为切入点，尝试去寻找相应的分子靶点，综合了高通量测序，TCGA公共数据挖掘，功能验证等多种手段来进行分析，概括如下
1. 环状RNA表达谱分析
首先从4个TNBC患者采集了癌和癌旁组织进行RNA_seq测序，构建去rRNA的文库，进行mRNA和circRNA的表达谱分析。对于环状RNA表达谱，以fold change 大于2，p值小于0.05为阈值，筛选出了354个差异表达的环状RNA, 其中47个上调，307个下调， 火山图结果如下
根据fold change分别从上调和下调的环状RNA中挑选10个最显著的环状RNA绘制热图，结果如下
其中hsa_circ_9958514是差异最大的，fold change为15.04，该环状RNA来源于AGFG1基因，来circBase数据库中有详细注释，挑选这个环状RNA进行后续验证。
2. mRNA表达谱分析
对于mRNA的表达谱，相同的阈值筛选出了3225个差异的mRNA,其中1007个上调，2218个下调，同样的方法挑选20个差异的mRNA,热图如下所示
其中CCNE1这个基因的表达量差异最大，fold chang为19.36, 所以后续锁定这个基因来进行验证。
对于差异基因，通过KEGG富集分析和GSEA两种方法分析富集到的通路，结果如下所示
两种结果中，都显示cell cycle这个通路被富集到。
3. 候选环状RNA的验证
通过PCR验证circAGFG1的存在, 并进行一代测序，获得该环状RNA的序列信息，结果如下如下，其中527bp就是该环状RNA的转录本长度，和circBase数据库中的记录一致
通过qRT-PCR验证环状RNA的差异，采用40个病人配对的癌和癌旁组织，共80个样本进行验证，结果如下
通过circAGFG1的表达量区分正常组织和癌组织，对应的ROC曲线如下所示
AUC大于0.5，说明可以有效的区分正常组织和癌组织。
通过生存分析发现circAGFG1的表达量与患者生存时间呈负相关关系，生存曲线如下
通过cox回归分析， 发现了TNM和circAGFG1的表达量这两个因素与生存时间显著相关，结果如下
通过卡方检验分析circAGFG1和病人临床特征之间的相关性，结果如下
T和N对应的p值小于0.05，即环状RNA与原发部位肿瘤大小，淋巴结转移情况相关。
3. 候选基因的验证分析
对于选定的CCNE1基因，首先通过RT-PCR验证差异，结果如下
利用TCGA数据库中收集的TNBC和正常组织的样本，进行差异分析和生存分析，结果如下
通过泊松相关分析探究circAGFG1和CCNE1之间的相关性，结果如下
发现二者成正相关关系。由于circAGFG1和CCNE1之间的正相关性，推测通过ceRNA机制来调控疾病过程。
4. circAGFG1和miRNA的相互作用分析
通过ArrayStar提供的mirna结合位点预测软件预测circAGFG1结合的miRNA, 发现circAGFG1与miRNA-195-5p存在结合，结果如下
然后通过荧光原位杂交FISH技术，定位miRNA-195-5p和circAGFG1在细胞质中，结果如下所示
再通过双荧光素酶报告基因检测系统验证环状RNA和miRNA之间的结合，野生型质粒中荧光值相对下调，证明circAGFG1和miR-195-5p存在直接的相互作用。
进一步通过设计circAGFG1 pull down芯片，验证和miRNA的结合，结果如下
相比对照探针，在circAGFG1探针富集结果中检测到了对应的环状RNA和miRNA。
对于找到的miRNA-195-5p, 同样做了RT-PCR验证，发现在肿瘤中表达量下调，结果如下
同时利用TCGA的数据，也进行了该miRNA的差异分析和生存分析，结果如下
TCGA的分析结果和自己的数据是一致的，都是下调，生存分析显示miR-195-5p和生存时间正相关。
5. mRNA和miRNA相互作用分析
根据TargetScan的分析结果，CCNE1和miRNA-195-5p存在相互作用，同样通过双荧光素酶报告基因检测系统来验证，结果如下
6. ceRNA关系验证
分别验证了circRNA-miRNA和mRNA-miRNA的相互作用之后，进一步验证circRNA和mRNA的调功关系，通过敲低和过表达circAGFG1, 利用RT-PCR研究circAGFG1和CCNE1表达量的关系，结果如下
在两种不同的TNBC组织中，候选的circRNA和mRNA都呈现正相关关系。
通过以上的各种证据，表明了circAGFG1,miR-195-5p,CCNE1三者之间确实构成了一个ceRNA调控关系。后续该文章还通过各种功能试验进一步验证和挖掘了ceRNA在该肿瘤中的作用机制，这里就不展开了。
通过这篇文献，大概总结出ceRNA分析和验证的一个思路
- 通过RNA_seq数据分析初步确定候选的各种RNA分子
- 结合TGGA公共数据库的结果和自己的测序数据相互印证
- 对于数据分析得到的差异表达趋势，通过RT-PCR验证
- 对于miRNA的靶标关系，通过双荧光素酶报告基因检测系统进行验证
- 对于ceRNA分子表达量上的相关性，通过knock down和overexpression进行验证
生信分析作为整个思路的第一环，其结果的可靠性和准确性尤为重要。
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