大肠杆菌全基因组重测序变异检测小实例（侧重变异过滤）

2020-03-03 15:07:44 浏览数 (1)

本文偏重对vcf文件的探索以及设置过滤标准

原文地址

Filtering and handling VCFs

fastq测序获取数据

未找到原文所用数据，本文使用GATK4.0和全基因组数据分析实践（上）文章中的大肠杆菌基因组作为参考序列，使用wgsim软件模拟生成双端150bp测序数据

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wgsim -N 80000 -1 150 -2 150 ../Reference_genome/ecoli.fa sim_1_reads_R1.fastq sim_1_reads_R2.fastq

wgsim -N 80000 -1 150 -2 150 ../Reference_genome/ecoli.fa sim_2_reads_R1.fastq sim_2_reads_R2.fastq

wgsim -N 80000 -1 150 -2 150 ../Reference_genome/ecoli.fa sim_3_reads_R1.fastq sim_3_reads_R2.fastq

-N指定生成reads的条数 -1 -2生成reads的长度 接下来是参考序列 接下来是fastq文件的名字

使用samtools变异检测获取vcf文件

这一部分参考文章

  • GATK4.0和全基因组数据分析实践（上）
  • Variant calling tutorial

基本流程： bwa比对 samtools变异检测 完整代码

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###构建索引
bwa index Reference_genome/ecoli.fa
bwa mem -t 4 -R '@RGtID:footSM:sample1' Reference_genome/ecoli.fa sim_reads/sim_1_reads_R1.fastq sim_reads/sim_1_reads_R2.fastq -o output_results/sim_1_aligned.sam
bwa mem -t 4 -R '@RGtID:footSM:sample2' Reference_genome/ecoli.fa sim_reads/sim_2_reads_R1.fastq sim_reads/sim_2_reads_R2.fastq -o output_results/sim_2_aligned.sam
bwa mem -t 4 -R '@RGtID:footSM:sample3' Reference_genome/ecoli.fa sim_reads/sim_3_reads_R1.fastq sim_reads/sim_3_reads_R2.fastq -o output_results/sim_3_aligned.sam

这里遇到的问题：

  • -R参数后面接的内容都是什么意思？
  • 学着在shell下写循环
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cd output_results
#SAM装换为BAM
samtools view -S -b -o sim_1_aligned.bam sim_1_aligned.sam 
samtools view -S -b -o sim_2_aligned.bam sim_2_aligned.sam 
samtools view -S -b -o sim_3_aligned.bam sim_3_aligned.sam 
#排序
samtools sort sim_1_aligned.bam -o sim_1_aligned.sorted.bam
samtools sort sim_2_aligned.bam -o sim_2_aligned.sorted.bam
samtools sort sim_3_aligned.bam -o sim_3_aligned.sorted.bam
#索引
samtools index sim_1_aligned.sorted.bam 
samtools index sim_2_aligned.sorted.bam 
samtools index sim_3_aligned.sorted.bam
#变异检测
time samtools mpileup -g -t DP,AD -f ../Reference_genome/ecoli.fa sim_1_aligned.sorted.bam sim_2_aligned.sorted.bam sim_3_aligned.sorted.bam > sim_variants_3sample.bcf

###其一
time bcftools call -v -c sim_variants_3sample.bcf > sim_variants_3sample.vcf
###其二
time bcftools call -f GQ,GP -vmO z sim_variants_3sample.bcf -o sim_variants_3sample_1.vcf.gz

这样就得到了最终的vcf格式的文件。

这里遇到的问题：samtools加上bcftools检测变异的各个参数的含义还不太明白！

接下来重复原文内容

查看vcf文件中检测到多少没有经过过滤的变异
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bcftools view -H sim_variants_3sample.vcf | wc -l
6918

通常获得的vcf文件都比较大，可以通过随机取样的方法获得小的vcf文件用于后续的分析

过滤vcf文件通常考虑四点：

  • Depth 深度（最小深度和最大深度）
  • Quality 质量值（>30）
  • Minor allele frequency 最小等位基因频率（MAF）
  • Missing data 缺失数据（如何过滤缺失数据需要具体情况具体分析，但是位点缺失率大于25%应该被舍弃）
计算等位基因频率
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cd ../
mkdir vcf_handling
cd vcf_handling
vcftools --vcf ../output_results/sim_variants_3sample.vcf --freq2 --out sim_variant_AF
计算每个个体的平均深度
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vcftools --vcf ../output_results/sim_variants_3sample.vcf  --depth --out sim_variant_depth
计算每个变异位点的平均深度
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vcftools --vcf ../output_results/sim_variants_3sample.vcf --site-mean-depth --out sim_variant_sitedepth
计算位点平均质量值
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vcftools --vcf ../output_results/sim_variants_3sample.vcf --site-quality --out sim_variant_sitequality
计算每个个体数据缺失率
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vcftools --vcf ../output_results/sim_variants_3sample.vcf --missing-indv --out sim_variant_missingindv

将以上获得的五个文件导出到本地电脑，利用R语言进行可视化展示

五个文件分别是

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sim_variant_missingindv.imiss
sim_variant_sitequality.lqual
sim_variant_sitedepth.ldepth.mean
sim_variant_depth.idepth
sim_variant_AF.frq
查看位点质量值分布
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setwd("../../vcf_handling/")
library(tidyverse)
var_qual<-read_delim("sim_variant_sitequality.lqual",
                     delim="t",
                     col_names=c("chr","pos","qual"),
                     skip=1)
library(ggplot2)
a<-ggplot(var_qual,aes(qual)) 
  geom_density(fill="dodgerblue1") 
  theme_light()
a1<-a xlim(0,100)
library(ggpubr)
ggarrange(a,a1,ncol=1,nrow=2)

image.png 从上图可以看出我们的位点质量值是偏低的，因为数据量比较小，位点质量值30代表检测出来的变异有千分之一的可能是错误的，推荐过滤变异的时候设置位点质量值大于30。

变异位点的平均深度
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summary(var_depth$mean_depth)
var_depth<-read_delim("sim_variant_sitedepth.ldepth.mean",
                      delim="t",col_names=c("chr","pos","mean_depth","var_depth"),
                      skip=1)
a<-ggplot(var_depth,aes(mean_depth)) 
  geom_density(fill="dodgerblue1",color="black",alpha=0.3) 
  theme_light()
a

image.png 覆盖度的最小值设置（We could set our minimum coverage at the 5 and 95% quantiles这句话暂时还没看懂是什么意思！） 覆盖度最大值的设置：推荐设置为平均深度的两倍（Usually a good rule of thumb is something the mean depth * 2, so in this case we could set our maximum depth at 40x）

平均缺失率
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INDV    N_DATA  N_GENOTYPES_FILTERED    N_MISS  F_MISS
sample1 6918    0       0       0
sample2 6918    0       0       0
sample3 6918    0       0       0

本次分析中的缺失率都为0，暂时还没想到是什么原因

最小等位基因频率
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var_freq<-read_delim("sim_variant_AF.frq",delim="t",
                     col_names=c("chr","pos","nalleles","nchr","a1","a2"),skip=1)
var_freq
var_freq$maf<-var_freq%>%
  select(a1,a2)%>%
  apply(1,function(z) min(z))
a<-ggplot(var_freq,aes(maf)) 
  geom_density(fill="dodgerblue1",alpha=0.3) 
  theme_light()
a

image.png 这部分的解释自己还没有太看懂，留待后续分解

根据位点质量值和测序深度过滤我们的vcf文件

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vcftools --vcf ../output_results/sim_variants_3sample.vcf --minQ 30 --min-meanDP 4 --max-meanDP 10 --minDP 4 --maxDP 10 --recode --stdout | gzip -c > sim_variants_filtered.vcf

参数含义： --vcf or --gzvcf输入未过滤的vcf文件 --minQ位点质量值 --min-meanDP位点最小平均深度 --max-meanDP位点最大平均深度 minDP the minimum depth allowed for a genotype maxDPthe maximum depth allowed for a genotype

剩下多少个变异
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bcftools view -H sim_variants_filtered.vcf.gz | wc -l
2212

过滤掉了将近三分之二

这样一次完整的变异检测流程就完成了，当然这其中还有好多细节部分的知识点需要学习！

fs image minimum png set

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