今天分享一篇2019年发表在EBioMedicine（IF:6.68）上的文章，标题是Identifification of candidate diagnostic and prognostic biomarkers for pancreatic carcinoma（胰腺癌诊断和预后生物标志物的识别）。
摘要
背景：胰腺癌（PC）是影响人类健康的最具侵略性的癌症之一。识别用于PC诊断和预后的候选生物标志物是必不可少的。本研究旨在探讨PC的诊断和预后生物标志物。
方法：从GSE62452，GSE28735和GSE16515的mRNA表达谱中识别差异表达基因（DEG）。进行功能分析和蛋白质-蛋白质相互作用网络分析以探索DEG的生物学功能。使用ROC曲线分析确定PC的诊断标记。通过对TCGA数据进行生存分析来确定预后标记。在临床组织样本中验证了所识别基因的蛋白质表达模式。进而评估候选蛋白表达与患者生存时间之间的相关性。此外，使用TCGA数据和临床数据对与PC预后相关的多种基因/蛋白质组合进行了综合分析。最后，进行体外研究以阐明这些生物标志物在PC细胞的克隆性和侵袭中的潜在作用。
发现: 识别了389个DEGs. 这些基因主要与胰腺分泌，蛋白质的消化吸收，细胞色素P450药物代谢和能量代谢通路有关。根据Fisher精确检验，筛选出了前10个基因。ROC曲线分析表明TMPRSS4，SERPINB5，SLC6A14，SCEL和TNS4可用作诊断PC的生物标志物。TCGA数据的生存分析表明，TMC7，TMPRSS4，SCEL，SLC2A1，CENPF，SERPINB5和SLC6A14可能是PC预后的潜在生物标志物。综合分析表明，识别的基因/蛋白质的组合可以预测PC的预后。从机制上讲，识别出的基因归因于PC细胞的克隆性和侵袭性。
结果概述
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识别PC中差异表达基因
与正常胰腺组织相比，GSE16515的基因表达谱识别出1118个差异表达基因，其中851个基因上调， 267个基因下调。GSE62452识别出325个差异表达的基因，其中PC上调基因204个，下调基因121个。GSE28735识别出495个差异表达基因，其中PC上调基因253个，下调基因206个。如下图所示：
为了对三个GEO数据集进行综合分析，应用Robust Rank Aggreg，选择得分<0.01的基因。最终共识别出389个一致表达的DEG，如下图所示：
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PC特异基因的功能特征
GO功能分析表明，DEGs主要富集在消化，异种葡萄糖醛酸化，蛋白水解和葡萄糖醛糖基转移酶活性的负调控等过程。KEGG通路富集分析表明，DEGs主要与胰腺分泌，蛋白质消化吸收，视黄醇代谢，细胞色素P450药物代谢，戊糖和葡糖醛酸酯相互作用等有关。如下图所示：
PPI网络分析发现PC的能量代谢途径可能发生改变，胶原蛋白分泌也发生了巨大变化。
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识别诊断PC的关键基因
首先，用Fisher精确检验从389个DEG中识别出关键候选基因。选择了前10个基因。见下表和下图所示：
对10个基因进行ROC曲线分析，评估其对PC诊断的敏感性和特异性。其中TMPRSS4、SERPINB5、SLC6A14、SCEL和TNS4的AUC值达到0.85，表明这些基因对PC诊断具有很高的敏感性和特异性。如下图所示：
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TCGA数据生存分析
使用TCGA数据对前10个基因进行生存分析。TMC7，TMPRSS4，SCEL，SLC2A1，CENPF，SERPINB5和SLC6A14与患者的预后密切相关。如下图所示：
作者进一步评估了这七个基因组合对PC的预后价值。使用七个基因在TCGA数据集上进行单变量Cox回归模型，使用Cox回归模型将患者分为高风险组和低风险组。Kaplan-Meier生存分析表明，高风险组患者的生存时间明显低于低风险组，表明7个基因可以联合预测PC预后，如下图所示：
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DEGs的验证
为了确认已识别的DEG（TMC7，TMPRSS4，SCEL，SLC2A1，CENPF，SERPINB5和SLC6A14）的可靠性，作者使用IHC检测了99个临床PC组织和71个配对的正常胰腺组织中这7个基因的蛋白表达。结果表明，与正常组织相比，这七种蛋白在肿瘤组织中均明显过表达。作者还注意到，II期患者的SLC6A14，TMPRSS4，SLC2A1（GLUT-1）和SERPINB5（MASPin）的表达明显高于I期患者。因此得出结论，这四个基因可能在早期阶段随着PC的发展而增加。如下图所示：
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综合分析以评估七种蛋白在PC预后预测中的作用
然后，作者进行了一项临床研究，以确定这7种蛋白是否可以预测PC患者的预后。对99名临床PC患者进行了生存分析，发现肿瘤组织中TMC7，TMPRSS4，SCEL，SLC2A1，CENPF，SERPINB5和SLC6A14的蛋白表达水平较高的患者与蛋白表达水平较低的患者相比，生存时间明显缩短。与基因结果一致，结果表明这七个蛋白也可以预测PC的预后。如下图所示：
此外，作者评估了7种蛋白质的组合对PC的预后价值。得出结论：高风险组患者的生存时间明显短于低风险组。如下图所示：
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敲除差异表达蛋白抑制了PC细胞的克隆性和入侵
作者用这七个基因的shRNA瞬时转染人胰腺癌细胞系，通过western blot验证转染效率，软琼脂分析显示，与对照组相比，TMC7基因敲除组的细胞克隆数要少，在对照组中观察到更多的通过膜细胞的细胞，而在TMC7敲除组中观察到的细胞更少，其它蛋白也得到了相似的结果。结果表明，敲除这些蛋白可以显著抑制PC细胞的克隆能力和侵袭能力。这表明这些蛋白质可以增强PC细胞的克隆性和侵袭能力。如下图所示：
本文的整体研究思路清晰，也比较简单，通过生物信息学分析筛选出胰腺癌预后生物标志物，并在蛋白层面得到了验证。通过实验进一步确定了预后相关基因编码蛋白的功能。
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