蛋白质组学第10期 定量方法介绍

2019-09-12 15:36:25 浏览数 (1)

知识回顾定量蛋白质组学一、无标定量（相对定量）1.概念2.原理参考文献3.理论基础方法一方法二4.流程5.特点二、有标定量1.概念2.原理3.种类4. ITRAQ1）参考文献2）原理3）ITRAQ4）实验流程5）峰谱结果6）特点5、SILAC1）基本原理和流程2）参考文献3）优势

知识回顾

我们先来回顾以下蛋白质组学bottom up的流程

先将蛋白用胰酶酶，酶切肽段上质谱检测，搜库软件搜库，数据分析

定量蛋白质组学

对处不同时期、不同条件下蛋白质表达水平变化的研究，识别功能模块和路径，监控疾病的生物标志物，这些研究都需要对蛋白质进行鉴定和定量 参考文献（Quantitative mass spectrometry in proteomics : a critical review）

文章展现了：代谢标记、化学标记、合成标准肽、无标定量（lable free)，虽然文章时间较早，但是对于不同方法的比较描述很清楚

一、无标定量（相对定量）

1.概念

无标记定量法是一种质谱分析方法，目的是测定两个或两个以上生物样品中蛋白质的相对含量，不使用含有稳定同位素的化合物蛋白质。

2.原理参考文献

基于质谱的定量蛋白质组学策略和方法研究进展. 中国科学 : 生命科学 , 2015.

3.理论基础
方法一

基 于离子流色谱峰(extracted ion current, XIC)的定量算 法（MaxQuant）

在保留时间(retention time, RT)轴上, 根据肽段母 离子的质荷比提取不同保留时间下的相应同位素峰 簇的信号强度, 重构 XIC, 并利用 XIC 的面积或信号 加和等指标作为肽段的定量结果.（Maxquant)

方法二

谱图计数（Spectral Counting）方法。

一个蛋白对应的二级谱图数目越多，丰度越高

4.流程
5.特点

无需使用昂贵的稳定同位素标签做内部标准，只需分析大规模鉴定蛋白质时所产生的质谱数据，比较不同样品中相应肽段的信号强度，从而对肽段对应的蛋白质进行相对定量。蛋白质无需标记，样本所需蛋白总量少，实验耗费低；无需复杂的标记步骤，操作简单，耗时短；适用范围广：不受样品条件限制，几乎可对任何物种的各类蛋白质进行鉴定 要求高：对液相色谱分离及串联质谱鉴定的稳定性和重复性要求较高，需要有足够的技术重复以确证结果的可靠性。

二、有标定量

1.概念

有标定量(stable isotopic labeling quantification) 是指利用稳定同位素标记样本后再进行相应的质谱 鉴定与定量分析的方法.

2.原理

相同肽段的不 同标记状态会在同一张质谱图中形成具有固定质量 差的同位素峰, 利用这些同位素峰可以计算出同一 肽段在每种标记状态中的丰度信息与相应的丰度 比值.

3.种类
4. ITRAQ

iTRAQ - isobaric Tag for Relative and Absolute Quantitation

1）参考文献

（Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents）

2）原理

ITRAQ试剂是可与氨基连接胺标记同重元素。在一级质谱中任何一种ITRAQ试剂标记不同样本中的同一蛋白质表现为相同的质荷比，从而表现为同一个质谱峰。在二级质谱中，ITRAQ试剂中的平衡基团发生中性丢失，信号离子表现为不同质荷比（114~121）的峰，因此根据波峰的高度个面积，可以得到同一蛋白在不同样本中的表达差异。

3）ITRAQ

ITRAQ试剂包括3部分

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    - 1.报告部分：8种质量分别为114~121Da的试剂，最多做8个标记

    - 2.肽反应部分：能与肽段N端发生共价连接，从而将报告部分和平衡部位标记到肽段上，可标记左右蛋白质

    - 3.平衡部位：质量数分别为31~42Da，与报告部分相互配合，保证ITRAQ试剂的不同样本的同一肽段具有相同质荷比。
4）实验流程
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    - 1. 蛋白提取
    - 2.胰酶酶切消化，形成酶切肽段
    - 3.每个样本添加不同的ITRAQ试剂
    - 4.等量混合各个样本。
    - 5.质谱检测
5）峰谱结果
  1. MS 一级谱，某一个蛋白分子量为1352.84
  1. MS/MS 二级谱

3.信号离子，分子量为114.1、115.1、116.1、117.1 的信号离子，这个四个峰的峰面积比值为所标记的不同样本中的蛋白量的比值。

6）特点

优势：灵敏度高，定量比较准确 缺点：价格昂贵，操作复杂

5、SILAC

细胞培养条件下稳定同位素标记技术(Stable isotope labeling with amino acids in cell culture，SILAC)

1）基本原理和流程

利用含轻、中或重型同位素标记的必需氨基酸（主要是Lys和Arg）培养基培养细胞，来标记细胞内新合成的蛋白质，一般培养5-6代，细胞中的蛋白质将都被同位素标记。不同处理的蛋白样品等量混合，经SDS-PAGE分离，切胶，酶消化，LC-MS/MS分析即可得到有关蛋白的定量及定性结果。

细胞生长过程中标记

实验组和对照组的标记

2）参考文献

（ Anna E Merrill , Joshua J Coon, Quantifying proteomes and their post-translational modifications by stable isotope label-based mass spectrometry. Curr Opin Chem Biol. 17, 1-8 (2013).）

3）优势
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  - 高通量，可同时标记细胞内的蛋白
  - 同位素标记效率高，不受裂解液的影响，具有较高的高重复性
  - 灵敏度高
  - 体内标记更真实
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