昨天Science文章背靠背揭示癌症中细胞感应氧气的新机制一文从表观水平分析了细胞中组蛋白修饰如何感知环境变化而发生不同的调控机制。
另一篇文章肿瘤化疗无效是对预先存在的突变的选择还是诱发新突变，Cell给你答案从单细胞基因组和转录组的角度探索突变产生的先后。
本文则是在单细胞基因表达水平和突变水平阐述基因突变、信号通路和细胞类型生成的关系。相比于其它单细胞文章的套路分析，本文的分析思路和深入挖掘值得学习。
摘要
目前，对负责器官多种稳态功能发挥的细胞类型的分子特征认识不完整，导致了人类对肾病发病机制的理解受限。为了弥补这个缺陷，该项目从健康的小鼠肾脏选择57,979个细胞进行无偏的单细胞RNA测序。基于基因表达模式和突变数据关联推断遗传性肾脏疾病起源于特异的基因突变，而且相同表型起源于相同的细胞分化类型。此外还发现成年小鼠的肾集合管通过一种新发现的转化细胞产生一系列新的细胞类型。细胞轨迹分析和体内谱系追踪揭示了夹层细胞和集合小管主细胞通过Notch信号通路调控而发生互转。在小鼠和人类的肾病中，这种转化趋向主细胞命运，且和代谢性酸中毒有关。
结果分析
小鼠肾脏细胞的scRNA测序和非监督聚类
为了更好的理解肾脏疾病的机制，作者从7只健康的雄性小鼠肾脏分离了57,979个单细胞，并采用droplet-based技术进行测序。经过QC处理后，保留43,745个细胞用于后续分析，聚类分析发现了16个cell cluster, 每个cluster的细胞数量从24到26,482个不等。为了确定聚类结果的可靠性，作者采用了一些质控方法，包括：
- 7只小鼠的细胞均匀分布于16个cluster；(表明无个体带来的批次效应)
- 线粒体基因的数量对聚类没有影响；
- 不同的聚类方法有相似的结果；
- 减少细胞数量可能会导致罕见细胞类型的丢失，或者增加不确定的细胞类型。
图1：A) 单细胞RNA测序揭示了小鼠肾脏细胞的多样性；无监督聚类发现了16种细胞类型，其中左图对cluster 1,3,7继续分亚型；每个cluster的细胞数目和比例显示在右表，其中缩写的意义为：Enno: containing endothelial, vascular, anddescending loop of Henle（含内皮、血管和亨式下降环细胞），Podo: podocyte（足细胞）, PT: proximal tubule（近端小管）, LOH: ascending loop of Henle (亨式上升环细胞), DCT: distal convoluted tubule（远曲小管）, CD-PC: collecting duct principal cell（集合管主细胞）, CD-IC: CD intercalated cell（集合管夹层细胞）, CD-Trans: CD transitional cell（集合管转化细胞）, Fib: fibroblast（成纤维细胞）, Macro: macrophage（巨噬细胞）, Neutro: neutrophil（嗜中性粒细胞）, NK: natural killer cell（自然杀伤细胞）。 B）和 C) 16个主要的细胞类型的特异性Marker基因的小提琴图；其中水平轴表示标准化后基因的多少表达。 (C) Cluster1 (from panel A left)分为endothelial cells（内皮细胞）, pericytes/vascular smooth muscle cells（周细胞/血管平滑肌细胞）和descending loop of Henle (DLH，亨式下降环). Cluster 3 (proximal tubules，近端小管) 分为S1, S2 and S3 segments or PCT (proximal convolutedtubules，近曲小管) and PST(proximal straight tubules，近端直小管)。 Cluster 7（intercalated cells，闰细胞）分为A 和 B 型闰细胞。
基于细胞类型的Marker基因对肾脏细胞分类
对各个Cluster进行Marker基因鉴定发现细胞分型与已知Marker基因很吻合，如内皮细胞 (endothelial cell)的Kdr基因，肾小囊脏层细胞（podocytes）的Nphs1和Nphs2基因，亨式上升环细胞（ascending loop of Henle）的Slc12a1基因，以及远曲小管（distal convoluted tubule）的Slc12a基因。
免疫细胞和内皮细胞虽然被上皮细胞所分开，但是输尿管芽（ureteric bud-，cluster 6-8）和后肾间质衍生上皮簇（metanephricmesenchymederived epithelial clusters，cluster 2-5）比较相似。此外作者还发现了大量的新的Marker基因，包括肾小囊脏层细胞（podocytes）的Cdkn1c和Bcam基因。
Cluster 1，3和7进一步聚类分为8个亚型。其中，cluster1可以分为内皮细胞（endothelial cells），周细胞/血管平滑肌/类肾小球系膜细胞（pericyte/vascular smoothmuscle/mesangial-like cells），以及降环的髓襻细胞（descending loop of Henle cells，DLH）；Cluster3 (proximaltubules，远曲小管)可以分为S1, S2 和S3直段或者近曲回旋直段（proximal convoluted and straightsegments），Cluster7（Intercalated cells）可以分为A，B两种类型的夹层细胞 (图1B，C)。
为了更准确对每个cell cluster 进行注释，作者将基因表达结果与取自显微结构小鼠肾脏区段的bulk RNA测序数据和人类免疫细胞类型的芯片数据做了相关性分析。此外还采用了转基因小鼠的免疫荧光蛋白标记等一些实验方法。最终，鉴定出18个已知的肾脏和免疫细胞类型，以及3个新的细胞类型（共计21个cluster）。
肾病相关孟德尔疾病基因表现出细胞类型特异性
作者接着提出一个假设：具有相同表型的遗传性肾脏疾病是否起源于相同的细胞类型？同时，还探究是否可以从发生功能缺失而导致肾病人类肾脏疾病相关基因的表达模式推断出特定小鼠肾脏细胞类型的功能？
以蛋白尿为例，已发现了29个单基因肾病基因，其中21个在小鼠中有同源基因，这些同源基因只表达于肾小球足细胞（podocyte of the glomerulus）；表明肾小球足细胞的功能异常才是导致蛋白尿的主要原因，而可能不是之前报道的内皮细胞和近端小管，尽管后者在患者中表现出相应的结构和功能变化。
此外，作者还发现与肾小管酸性中毒相关的小鼠同源基因仅表达于集尿管的夹层细胞 (IC)，表明这些细胞在酸碱稳态平衡中的主要作用。对于孟德尔型高血压疾病，其相关基因Wnk4, Wnk1, Klh3和Slc12a3等也特异的表达于远曲小管（图2A）。
接着，作者发现不仅对于单基因疾病，对复杂疾病（如高血压、慢性肾病、血清代谢物水平肾结石、肾小管性酸中毒等）也有这样的规律，即相关基因仅特异表达于单一的细胞类型。因此，单细胞RNA分析表明特定的细胞表达特定的基因，发挥着特定的功能，决定着特定的肾脏相关疾病（图2B）。
图2. 特异的细胞类型上的基因突变导致独特疾病表型。（A）单基因疾病；（B）GWAS鉴定的复杂性状基因。此图主要表现不同的肾病基因在不同的细胞类型中的表达情况。可以发现，不管是对单基因疾病还是复杂疾病，都表现出同一表型疾病的致病或者易感基因都特异的高表达于特定的一类或几类细胞类型。
鉴定和证实肾集合管新的细胞类型及其可塑性
肾集合管至少有三种独特的细胞类型组成：主细胞（principalcells，PC），主要负责钠和水的再吸收以及钾的分泌；alpha和beta夹层细胞 (A-IC和 B-IC)，负责酸和碱的分泌；鉴定出Aqp2和Atp6v1g3基因是cluster 6和7的marker基因，从而确定 cluster6 和7分别为PC 和IC细胞；意外的是，聚类分析还发现了第三个cluster (cluster8, Trans),该cluster同时表达IC和PC细胞的marker基因，同时还表达细胞类型特异的marker基因 Syt7（图3A, B)。这些基因的表达情况和该细胞类型被光染色和荧光原位杂交实验所证实(图3D, E,F)。
为了更进一步的研究此细胞类型，采用Monocle对cluster 6-8进行细胞轨迹分析,发现中间态细胞位于PCs 和ICs之间；同时，细胞轨迹分析也清晰的将IC分为A-IC和B-IC亚型，而且PC细胞也呈现出它的亚型（图3G）。这些结果表明IC和PC细胞表现为细胞表型的两个终端，而且这种细胞可能正经历着细胞间的转换。接着，作者还采用了传统的体内谱系追踪实验来进一步证实这种转化态细胞类型的存在，从而证明了肾集合管细胞的可塑性。
图3，鉴定一类转化态细胞和肾集合管的转换过程。A)三个marker基因在16个cluster的表达情况；B）PC，IC和转化态细胞的三个marker基因的表达情况；C，F)免疫荧光实验证明Marker基因的表达；D，E) 肾集合管不同细胞类型的基因表达热图和差异基因Venn图；G)拟时序分析表明IC和PC间存在着一个转化态细胞类型；（H，I）谱系追踪。
Notch配体和受体互作驱动的集合管细胞可塑性导致慢性肾病
为了进一步分析集合管细胞可塑性，作者鉴定了PC和IC之间的转换过程中表达发生变化的基因。PCs细胞富集细胞粘连、水平衡和盐运输的基因，而ICs细胞富集ATP水解/合成、耦合质子运输和氧化还原基因（图4A）。这些基因表达情况揭示了Notch信号通路在IC到PC的转换中被激活。Notch通过表达Notch配体或者Notch受体调节邻近细胞的识别。一般而言，PCs 高表达Notch2受体基因，而ICs高表达Notch2配体基因（图4A）。免疫荧光实验确认了IC细胞特异表达Notch 配体基因JAG1 (图4B)。这种信号通路调控的细胞间转换也被Pax8rtTA/NICD mice实验所证实（图4 C, D）。在病人和肾脏疾病小鼠模型中均发现Notch基因的高表达，因此可以猜测疾病状态干扰着IC和PC细胞的比例。该猜想被叶酸诱导的慢性肾病小鼠模型（该小鼠模型主要是模拟慢性肾病（CKD）患者，以代谢性酸中毒为主要症状）所证实（图4E，F，I）。总之，数据表明：
- IC到PC的转换是受 Notch受体和配体表达的调节的；
- 在小鼠模型或者CKD患者中，趋向于PC的转换可能是导致代谢性酸中毒的原因。
图4，Notch配体和受体的表达驱动着IC-to-PC的转化。A) Notch基因在发育轨迹时间轴细胞的表达图谱；B）肾脏集合管的双免疫荧光着色实验展示AQP2和JAG1的表达：AQP2（红色）和JAG1(绿色)；C)和D)通过构建NICD小鼠，与野生型小鼠比较，可以发现NICD小鼠的PC细胞含量上升（Aqp2 ），IC细胞含量降低 (Atp6v1 )，即证明IC到PC的转化；E-I）通过构建酸中毒小鼠模型，也可以发现PC细胞含量上升（Aqp2 ），IC细胞含量降低(Atp6v1 )，以及IC到PC的转化；证明了Notch基因的高表达驱动了IC-to-PC的转化，破坏了原有的平衡。
总结
本研究通过对小鼠肾脏的大规模单细胞RNA测序，发现了16种细胞类型，并对每种细胞类型进行了生物学注释。
接着，作者通过研究肾病相关的基因在不同细胞类型的表达情况证明了肾病相关基因在肾脏中的表达具有细胞特异性，也证明了特定基因—特定细胞—特定表型的对应关系。
随后，作者对发现的3类集合管细胞进行深入分析，发现IC和PC之间发生着转化，即存在着一类过渡转化细胞。差异分析则揭示出Notch信号通路在这种转化中的驱动作用。而且证明了肾病患者中出现的Notch表达上升驱使着IC到PC的转化，破坏原有的转化平衡。
总之，本研究相比于一般的图谱类研究揭示了更多的生物学规律和机制，而且研究的选择很有特色，并非对每个cluster泛泛而谈。特定基因—特定细胞—特定表型的对应关系的证明可以在其他疾病中尝试，是一个很好的模式；同时，对IC和PC的转化研究也阐述的比较深刻。大量的实验也使得文章的结论扎实，具有说服力。总之，此文工作量、工作的创新性和结果的创新性上均十分出色，最终能发表Science，亦是名至实归。
参考文献：Park J, Shrestha R, Qiu C, et al. Single-cell transcriptomics of the mouse kidney reveals potential cellular targets of kidney disease[J]. Science, 2018, 360(6390): 758-763.
