干扰MYC-WWP1通路重新激活PTEN的抑癌活性——3步搞定GSEA分析

2019-06-10 15:38:16 浏览数 (1)

你好啊，欢迎来到周一数据挖掘专栏，我是新学徒Christine，很高兴和你一起学习！ 以后将由我负责带领大家进行数据挖掘实战训练。 菜鸟团（周一数据挖掘专栏）成果展 （如果大家感兴趣前面学徒的教程，可以收藏学习）

继上周的免疫治疗明星分子PD-L1，这周我们来看癌症中另一个“闪耀的明星”PTEN的新研究，文章标题是：Reactivation of PTEN tumor suppressor for cancer treatment through inhibition of a MYC-WWP1 inhibitory pathway，上个月发表于Science。。

文章简介

PTEN（Phosphatase And Tensin Homolog）是一个重要的抑癌基因，编码的蛋白具有蛋白磷酸酶和脂质磷酸酶活性，能拮抗PIK3-AKT信号通路，调控细胞增殖、生长和代谢。PTEN在多种肿瘤中发生高频突变，但通常没有发生完全失去活性，多表现为单等位基因上的功能缺失，亚细胞定位异常，或者发生特殊的翻译后修饰，因为完全的PTEN缺失会给癌细胞带来衰老问题，当然这也给靶向PTEN的治疗带来了机会。

研究目的：已知PTEN发挥功能需要细胞质膜上形成二聚体，但原因未知。作者希望找到调控PTEN二聚化及膜定位的机制，进而研究出恢复PTEN活性的方式。

文章大致思路：

  • 作者对PTEN进行共免疫沉淀，找到一个与PTEN直接物理互作的蛋白WWP1（E3泛素连接酶）
  • 证明WWP1引起PTEN聚泛素化，从而抑制PTEN的二聚化和膜定位，使其不能发挥抑癌作用
  • 发现并验证MYC-WWP1-PTEN调控信号链
  • 通过结构模拟和生化分析得到一个WWP1的潜在抑制剂IC3（来源于十字花科蔬菜）

本次我们复现的图是Fig4F：野生型和Wwp1敲除小鼠RNA-seq的GSEA分析图，用于说明Wwp1敲除影响PI3K-AKT信号通路。

Fig4

Step1. 下载数据

野生型和Wwp1敲除小鼠的RNA-seq数据存放在GSE126789，但是作者没有给整理好的Matrix文件，需要下载GSE126789_RAW.tar自己整理一下。

代码语言：javascript复制
rm(list = ls())  
options(stringsAsFactors = F)
# 下载GSE126789_RAW.tar
# 批量读取文件处理为表达矩阵
dir <- "./raw_data/GSE126789_RAW/"

files <- list.files(path = dir, pattern = "*wwp1.*.txt.gz", recursive = T) #找到wwp1的WT和敲除样本
expr <- lapply(files,
               function(x){
                 # 只读取基因名和count
                 expr <- read.table(file = file.path(dir,x), sep = "t", header = T, stringsAsFactors = F)[,c(1,7)]
                 return(expr)
               })
df <- do.call(cbind, expr)
rownames(df) <- df[,1]
df <- df[,seq(2,ncol(df),by=2)] #去掉重复读取的基因名
colnames(df) <- substr(files,1,10) #列名为样本名
df <- df[apply(df, 1, sum)!=0,] #去掉在所有样本中count都为0的基因
grouplist <- c(rep("KO",3),rep("WT",3)) #记录下分组信息

expr <- df
save(expr,grouplist,file = "./expr_group.Rdata")

Step2. 差异表达分析

上一步中得到的是原始的count，可以直接用Deseq2进行差异分析，用edgeR或limma中的voom方法也是可以的，但是要记得标准化表达数据。

代码语言：javascript复制
## 差异分析
#原始的count可以用DESeq2做差异分析，表达矩阵需要为integer
exprSet <- apply(expr, 2, function(x){as.integer(x)})
rownames(exprSet) <- rownames(expr)
library(DESeq2)

colData <- data.frame(row.names=colnames(exprSet), 
dds <- DESeqDataSetFromMatrix(countData = exprSet,
                              colData = colData,
                              design = ~ group_list)
#使用DESeq函数进行估计离散度，然后进行标准的差异表达分析，得到res对象结果
dds <- DESeq(dds)
res <- results(dds, 
               contrast=c("group_list","KO", "WT")) #提取差异分析结果
DEG <- as.data.frame(res)
DEG <- na.omit(DEG)
nrDEG <- DEG[,c(2,6)] #第6列是padj

Step3. GSEA分析

GSEA：Gene Set Enrichment Analysis，一种基于基因集的富集方法，简单来说就是使用预定义的基因集（一般来自MSigDB数据库），将基因按照某种指标排序，查看这些基因在关注的基因集中是否出现显著统计学富集。

关于GSEA需要了解的内容很多，我把一些相关的资料放在了文末，大家一起学习！

这里我直接用了clusterProfiler包，按照log2FoldChange对基因排序，结果看起来还可以。

代码语言：javascript复制
library(clusterProfiler)
BiocManager::install("org.Mm.eg.db") # 下载小鼠的OrgDB包
library("org.Mm.eg.db") 

#将ENSEMBL ID转换为ENTREZID，用于GSEA分析
eg <- bitr(geneID = rownames(nrDEG), fromType = "ENSEMBL", toType = "ENTREZID", 
           OrgDb = org.Mm.eg.db)
nrDEG$EZTREZID <- eg[match(rownames(nrDEG),eg$ENSEMBL),2]
nrDEG <- na.omit(nrDEG[order(nrDEG$log2FoldChange,decreasing = T),])
# 得到一个按log2FoldChange排序的genelist
gene_list <- nrDEG$log2FoldChange 
names(gene_list) <- nrDEG$EZTREZID

# GSEA分析
kk <- gseKEGG(gene_list, organism = "mmu")
gesa_res <- kk@result
# 画PI3K-AKT的GSEA图，编号为“mmu04151”
gseaplot(kk, "mmu04151", by = "runningScore",
          title = "KO vs WT nKEGG PI3K/AKT Signaling Pathway")

GSEA

和文章中的图基本一致，文中Fig5I还有2张类似的GSEA图，只是选用的样本不同，有兴趣的小伙伴可以做一下试试~

Fig5

数据挖掘

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