一代测序:桑格尔-双脱氧链终止法
读长长(1000bp),准确性高,通量低
通过放射性同位素标记的ddNTP,其在DNA合成过程中不能形成磷酸二酯健,可以中断反应
二代测序:循环阵列合成测序法
读长短,时间段,通量高
不同荧光标记四种不同的dNTP,捕捉荧光信号并通过特定的计算机软件处理,获得待测DNA的序列信息。
一些名词:
测序流动槽flowcell:测序反应的载体容器,一个flowcell有8个lane
lane:测序反应的平行泳道,试剂添加、洗脱的位置
tile:每次荧光扫描的位置,肉眼看不到
双端测序:两边各测120-150bp
junction:双端测序中间一些没有测到的区域
flowcell构造:一个lane含有两列,每列有60个tile,每个tile会有不同的cluster,每个tile在一次循环中拍照4次
边合成边测序流程:
构建DNA文库:利用超声将DNA分子大段,用酶补齐末端,3‘端加A碱基,再在两端加上互补配对的adapter;
上样:lane上的接头应该与待测序列的接头一致;
桥式PCR:序列扩增;
测序:一次加一个应该,用完失效
数据产出
三代测序:单分子实时DNA测序
读长较长,样本制备简单,准确率较低
SMRT技术;纳米孔单分子测序技术;